[发明专利]一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法

权利要求书

1.一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、组织样品处理：称取约1g的各组织样品，加图1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min；

S2、病毒基因组DNA提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取病毒基因组；

S3、引物与探针设计：在GenBank中检索马立克氏病病毒的Meq基因，通过Meglign软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在Primer Premier 5的辅助下，设计Meq基因特异性MIRA引物和探针；根据马立克氏病病毒的Meq基因片段大小为1020bp，在PrimerPremier 5的辅助下设计全长引物，进行PCR扩增；

S4、PCR产物回收及纯化：根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；

S5、标准质粒的构建：根据pMD^TM19-T Vector Cloning Kit使用说明书，构建pMD-19T-MDV-Meq重组质粒；

S6、重组质粒鉴定：取部分培养菌液进行测序服务，并在NCBI网站的BLAST功能和Meglign软件与基因全长进行比对分析；

S7、质粒DNA小量抽提：根据SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pMD-19T-MDV-Meq重组质粒备用；

S8、马立克氏病病毒荧光检测体系建立

S81、体系建立：根据DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)使用说明书，进行荧光结果检测体系建立；

S82、引物筛选：使用上一步建立的荧光结果检测体系，对马立克氏病病毒的Meq基因的引物进行筛选实验，对比结果。

2.根据权利要求1所述的一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法，其特征在于：所述步骤S2具体为：

S21、用移液器将20ul proteinase K加入一个干净的1.5ml离心管；

S22、向离心管中加入200ul血清；

S23、加入200ul Carrier RNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15s混匀；

S24、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；

S25、加入520ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15s，彻底混匀，在室温下(15-25℃)放置5min；

S26、简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；

S27、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

S28、小心打开吸附柱盖子，加入500ul缓冲液GD，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

S29、小心打开吸附柱盖子，加入600ul漂洗液PW，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

S210、重复步骤S29；

S211、小心打开吸附柱盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；

S212、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全边干，弃废液；

S213、将吸附柱放入一个RNase-Free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150ul RNase-Free ddH₂O，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min。

3.根据权利要求1所述的一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法，其特征在于：所述步骤S3中PCR扩增体系为20μL，其中Mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板2μL，灭菌水6μL。