[发明专利]一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法

权利要求书

1.一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述方法为采用RNAi降低晚锦橙中CsWRKY43的转录水平，CsWRKY43基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

包括以下步骤：

（1）克隆晚锦橙CsWRKY43编码基因的RNAi片段，RNAi片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

（2）构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体：

（2.1）将步骤（1）中CsWRKY43编码基因的RNAi片段分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切；（2.2）将酶切回收的两组片段同时连接到pUC-RNAi载体，得到中间载体pUC-RNAi-CsWRKY43；（2.3）将中间载体pUC-RNAi-CsWRKY43和pLGNe超量表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别双酶切；（2.4）将中间载体含有RNAi片段的酶切产物连接到pLGNe载体上；（2.5）连接转化至感受态细胞，提取质粒，得到干扰表达载体pLGNe-CsWRKY43-RNAi；

（3）干扰表达载体转化晚锦橙，得到转基因植株。

2.根据权利要求1所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，晚锦橙CsWRKY43编码基因的RNAi片段的克隆方法为：提取晚锦橙总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用高保真酶PCR扩增得到CsWRKY43编码基因的RNAi片段。

3.根据权利要求2所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，PCR扩增所采用的引物为CsWRKY43-RNAi-F和CsWRKY43-RNAi-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

4.根据权利要求1所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（3）中，干扰表达载体转化晚锦橙的方法为：通过电击法将干扰表达载体质粒导入根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化晚锦橙外植体，遗传转化后的外植体细胞再经离体培养、染色鉴定、嫁接、PCR验证和qRT-PCR验证后得到转基因植株。

5.根据权利要求4所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（3）得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsWRKY43干扰与晚锦橙溃疡病抗性的相关性。

6.根据权利要求5所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-CsWRKY43-F和ID-CsWRKY43-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求6所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于， PCR验证后，用qRT-PCR验证转基因植株中CsWRKY43的转录水平，目的基因检测采用的引物为RT-CsWRKY43-F和RT-CsWRKY43-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。