[发明专利]一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法

说明书

本发明公开了一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，采用RNA干扰(RNAi)降低柑橘属植物中CsWRKY43的转录水平，其中，CsWRKY43编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；具体包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段；(2)构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体；(3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。本发明通过克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段，构建干扰载体，然后转化柑橘，得到的转基因植株溃疡病病斑面积可最大降低至现有柑橘的64％，病情指数可最大降低至现有柑橘的61％，能够显著的减轻溃疡病的发病程度。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法。

背景技术

近年来，我国柑橘产业发展迅猛，逐渐成为南方山区的主要经济支柱。然而，柑橘产业发展却饱受柑橘溃疡病等病害的制约。柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是由地毯草黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.Citri，Xcc)引起的细菌性病害，其危害当前大多数主栽柑橘品种。因此，加强对柑橘溃疡病防控研究是柑橘产业发展的迫切需求。

柑橘溃疡病的传统防控手段(病树焚烧和农药使用等)需要投入大量人力和物力，且会造成巨大环境危害。因此，柑橘溃疡病防治更多寄希望于培育抗病新种质。分子育种由于可定向、高效培育抗病新种质，目前得到快速发展和广泛应用。近年来，通过生物技术手段已获得一些抗溃疡病的柑橘资源，例如转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系；过表达CsBZIP40的晚锦橙株系；基因定点编辑柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子获得的对柑橘溃疡病抗性提高的植株等。但优质候选基因仍然匮乏，且功能和作用机制研究不深，致使多基因协同对抗溃疡病还难以实现，制约了柑橘抗溃疡病分子育种的发展。因此，亟待有针对性地挖掘更多与柑橘溃疡病紧密相关的基因，深入解析其功能和机制，用于抗溃疡病分子育种。

自1996年WRKY转录因子被首次报道在应对病原体方面发挥一定的调控作用以来，越来越多的研究聚焦于WRKY转录因子在植物抗病中的功能。不同的WRKY转录因子在植物免疫防御反应中功能各异。利用WRKY基因进行抗病分子育种具有重大的潜力。但是，植物WRKY转录因子家族成员众多，而且各成员的功能和机制也多种多样，利用WRKY进行抗病分子育种的尝试还不多，尚没有利用RNAi介导的WRKY沉默提高柑橘对柑橘溃疡病的抗性研究和应用。

研究中发现，受Xcc诱导后CsWRKY43在感病品种晚锦橙中表达量总体呈上升趋势，与之相反，在抗病品种四季橘中CsWRKY43的表达量呈下降趋势，暗示CsWRKY43是溃疡病的一个感病基因。CsWRKY43可以通过正调控下游的活性氧清除相关基因的表达降低植株的活性氧水平，活性氧在植物抗病过程中有积极的调控作用，所以推测CsWRKY43干扰可能降低活性氧清除相关基因的表达进而增加植株的活性氧水平和溃疡病抗性。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本发明为提高柑橘对溃疡病的抗性，提供一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，该方法通过将CsWRKY43编码基因的干扰载体整合到柑橘中，降低CsWRKY43的转录水平，能够显著提高柑橘对溃疡病的抗性，并且不影响转基因植株的表型。

本发明通过下述技术方案实现：

一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，所述方法为采用RNA干扰(RNAi)降低柑橘属植物中CsWRKY43的转录水平，其中，CsWRKY43编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；具体包括以下步骤：

(1)克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段；

(2)构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体；