[发明专利]检测黄芪及土壤中根腐病菌尖孢镰刀菌的引物和PCR方法

说明书

本发明提供了一种检测黄芪及土壤中根腐病菌尖孢镰刀菌的引物和PCR方法，所述的引物，其核苷酸序列为：FaeF2：5’—GGCATTTACTCCGCCACTTG—3’，FaeR2：5’—AGCTCAGCGGCTTCCTATTG—3’。本发明还提供了利用所述的特异性引物快速检测黄芪及土壤中根腐病菌尖孢镰刀菌的方法，该检测方法灵敏度高、特异性强，且具有操作方便、成本低、结果直观等特点。可用于田间黄芪植株或其种植区土壤中根腐病菌尖孢镰刀菌的特异分子检测，也可作为土壤中病原菌含量的预警检测方法。本发明为针对黄芪根腐病进行靶向性早期防治和科学合理用药提供直接依据的有力技术手段，对减少根腐病造成的经济损失具有重要意义。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种黄芪根腐病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)分子检测的特异引物及其在黄芪及土壤中的实时荧光PCR检测方法。

背景技术

黄芪，具有补气固表，托疮生肌等功效，是中医药学公认的道地大宗药材和保健品原料，以其为原料的中成药多达200余种，上市保健品达160余种，民间也将黄芪作为重要的滋补食材。近年来，黄芪的市场需求激增，出口、药用、食用和其他用途的年需求量在8.85万吨以上。然而，随着种植面积扩大、轮作周期缩短、重茬和迎茬面积增加等因素，素有“植物癌症”之称的根腐病在甘肃、山西、内蒙等主产区普遍发生，且危害逐年加重，如甘肃渭源和定西，发病率分别为40％-60％和35％-92％；内蒙古为30％-80％；山西一般为10％-30％，重者达60％。根腐病的发生蔓延给黄芪产业的发展造成了严重影响，经济损失巨大。

尽早准确判别植物病害和明确其致病菌/群，是对病害进行有效防控的最关键一环。然而，黄芪根腐病致病菌的复杂性、症状的多样性、发病的隐蔽性和多年性，给该病害的早期鉴别和针对病原实施精准防控造成了极大困扰。首先，黄芪根腐病由多种病原菌混合侵染引起，镰刀菌属的腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、锐顶镰刀菌(Fusariumacuminatum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是最主要的致病菌，且不同地区优势致病菌存在差异，如甘肃省渭源县黄芪根腐病的优势致病菌为尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌；内蒙古以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为主要致病菌，其次是尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌；山西省为锐顶镰刀菌、腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌。其次，黄芪根腐病症状多样，具有一定地域差异，且引发不同症状的优势致病菌也不尽相同。以山西为例，纤维状腐烂和皱缩变软在浑源、应县和五寨县均有分布，前者以浑源县和五寨县为多，后者以应县居多；而侧根发黑在浑源县未被发现。引起纤维状腐烂的致病菌，浑源县主要为锐顶镰刀菌、腐皮镰刀菌，五寨县为锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌，应县则为锐顶镰刀菌；引起皱缩软根症状的致病菌，五寨县主要为尖孢镰刀菌、锐顶镰刀菌、腐皮镰刀菌；浑源县为链格孢菌(Alternaria spp.)、锐顶镰刀菌、腐皮镰刀菌；应县为腐皮镰刀菌和锐顶镰刀菌；引起侧根发黑的致病菌，五寨县和应县均主要为锐顶镰刀菌和腐皮镰刀菌。第三，黄芪根腐病作为土传病害具有隐蔽性。当症状在植株地上部肉眼明显可见时，根部往往已是病害发生的中后期，此时常规施用农药已基本无效，药农不得不加大用量；加之黄芪为多年生植物，为了防止病菌在后续生长年份继续经土壤传播危害，还需要长期用药加以控制。如此，农药用量一再加大，很难控制在合理的范围。

目前，黄芪根腐病病原菌的鉴定通常采用的是先从发病组织中分离和纯化、再通过形态学和分子生物学技术加以鉴定，这种鉴定方法通常耗时长达半年以上，无法实现病菌的快速鉴定。在田间，症状观察是根腐病诊断的唯一手段，但根腐病早期症状的不明显和隐蔽性，常使得即便药农凭经验通过田间症状观察发现了病害，也往往已到发病后期；加之根腐症状的多样性，也常导致病害诊断的准确性难以保证。上述种种情形，使根腐病的防治要么“药不对病”、“药不对菌”，要么病害发现太晚，贻误防治时机，最终导致病害防治失败或农药大/超量使用却收效甚微，甚至因农药残留而影响黄芪的品质、污染种植地的土壤环境、造成生态危害。