[发明专利]一步法生产γ-氨基丁酸的方法及其菌株构建

说明书

本发明公开了一步法生产γ‑氨基丁酸的方法及其菌株构建，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明构建了一种可用于γ‑氨基丁酸生产的谷氨酸棒杆菌底盘细胞，并通过表达谷氨酸脱羧酶GAD酶突变体，提高了重组谷氨酸棒杆菌在pH 7.0条件下从葡萄糖一步法发酵生产GABA的产量，使GABA产量达到114 g/L，是目前报道最高值，且极大降低了成本，使GABA生产成本可小于谷氨酸生产成本。

技术领域

本发明涉及一步法生产γ-氨基丁酸的方法及其菌株构建，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳的非蛋白氨基酸，它在自然界中广泛存在，从微生物到植物和动物，具有预防及治疗失眠、降压、抗焦虑、镇静、镇痛、利尿等功能，可用于治疗各种神经功能障碍。GABA作为合成2-吡咯烷酮和可生物降解材料-聚酰胺尼龙4的前体也受到了广泛的关注，进一步将其应用领域扩展到工业领域。

GABA的合成有很多方式，包括化学合成，酶促或全细胞生物催化和微生物发酵。与化学合成相比，GABA的生物合成具有许多优势，如简单的后处理程序，更温和的反应条件，较高的产品收率，更高的产物选择性以及更低的环境污染性等。GABA生物合成的主要途径是经L-谷氨酸由谷氨酸脱羧酶GAD催化的不可逆的脱羧反应。谷氨酸脱羧酶（GAD）能够以磷酸吡多醛（PLP）作为辅因子催化将谷氨酸（Glu）生成GABA，是GABA生产的关键性酶。已经有一些国内外的文献报道了关于用谷氨酸棒杆菌生产GABA，在2011年，研究人员首次报道了在谷氨酸棒杆菌中表达来自短乳杆菌Lb85的谷氨酸脱羧酶能够产低浓度但可检测的GABA。另有报道利用外源表达大肠杆菌W3110的GadB，重组谷氨酸棒杆菌经过优化的发酵过程可产生12.37 g/L的GABA。Zhang等人基于重组谷氨酸棒杆菌，从葡萄糖开发有效的直接生物合成途径，无需添加昂贵的PLP辅因子，通过两阶段pH控制策略发酵70小时，GABA产量达到70.6 g/L。

谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成GABA，该反应消耗质子，从而可以增加环境的pH值。许多谷氨酸脱羧酶在pH4至5范围内均表现出最佳活性，并且其活性在pH值高于6时急剧下降，在pH 7时几乎失活。有些研究报道了一些突变体，提高其在中性pH下活力，但目前研究中，谷氨酸脱羧酶突变体的最适pH都没有改变，大部分没能提高pH高于6时的酶活，在pH7.0条件下仍几乎失活。

目前市场上GABA的生产都是利用谷氨酸作为前体，通过全细胞或者酶催化来实现，而从葡萄糖直接发酵产GABA更具成本优势。生物合成谷氨酸需要在pH 7.0的中性条件下，但GAD最适pH为4至5，在pH 7.0条件下几乎失活。所以即使GABA直接发酵的研究，也一般运用两步法发酵：第一步，中性pH（pH 7左右）条件下产谷氨酸；第二步，酸性pH（pH 5左右）产GABA。与一步法直接发酵生产GABA相比，两步法会导致发酵时间过长，产量较低，成本增加。在常用工业底盘菌株内，与大肠杆菌等相比，谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是安全的生产菌株（General Regarded As Safe, GRAS），其生产的GABA可应用于食品。谷氨酸棒杆菌还是出色的谷氨酸生产菌，而谷氨酸是GABA的直接前体，所以谷氨酸棒杆菌是大规模生产GABA的潜力菌株。总之目前市场中以谷氨酸为底物的全细胞及酶催化，或者两步法发酵，相比较一步法直接发酵，成本都会更高。

发明内容

为解决现有的谷氨酸脱羧酶pH不适用于GABA一步法生产，及全细胞催化，酶催化和两步法生产GABA存在的诸如成本高、产量低、工艺复杂等缺陷，本发明提供了一种在pH7.0条件下具有较高活性的GAD酶突变体及能够利用葡萄糖一步法生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌。

本发明提供了可用于一步法生产GABA的重组谷氨酸棒杆菌，表达谷氨酸脱羧酶，并进行了如下至少一种改进：

（1）敲除丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknG；所述丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknG的Genbank登录号为BAC00145.1；