[发明专利]一种AAV滴度的检测方法

说明书

本发明属于基因治疗领域，应用于腺相关病毒（AAV）生产过程中及最终纯化成品AAV病毒的滴度测定。通过本项目的优化能够开发一种特异性好并且准确可靠的AAV滴度检测方法，用于AAV生产过程中细胞内AAV和纯化AAV的基因组滴度测定。

技术领域

本发明属于基因治疗领域，应用于腺相关病毒（AAV）生产过程中及最终纯化成品AAV病毒的滴度测定。

背景技术

重组腺相关病毒由于它的安全性和有效性，现已经成为基因治疗的常用载体，2012年第一个用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病（LPLD）的基因治疗药物Glybera在欧洲上市，2017年用于治疗由于RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病（IRD）的基因治疗药物voretigene neparvovec-rzyl在美国批准上市，次年在欧盟获批上市。目前有很多针对神经系统疾病和眼科疾病的重组AAV基因治疗药物正在临床前研究当中，2021年AGTC与Biogen宣布合作开始基因治疗XLRP的I/II期临床试验，该疗法使用新型重组AAV载体(rAAV2tYF-GRK1-RPGR)递送RPGR载体，用于治疗由RPGR基因突变导致视网膜色素变性而致盲。RegenXBio公司使用AAV8递送抗VEGF的Fab抗体，用于治疗湿性AMD，该药物目前处于Ⅲ期临床阶段。ADVERUM公司使用AAV7m8递送抗VEGF的蛋白用于治疗湿性AMD，并在2021年开始临床实验。Amicus公司目前有9个临床和临床前AAV药物用于治疗遗传性神经系统疾病。

发明内容

本发明针对包装细胞中AAV的定量优选地使用含Tx-100的低渗PBS缓冲液裂解细胞，整个裂解过程快捷方便，细胞裂解充分，使得检测结果稳定。

优选地自配制裂解液包含裂解液1：1% Tx-100 in 0.25 x PBS；

优选地自配制裂解液包含裂解液2：50mM Tris -HCl ，2 mM MgCl2 ，200mM NaCl，1%(w/v) 吐温 80 ，pH 8.0；

优选地，商品化细胞裂解液为Takara 细胞裂解液solution A和solution B。

又一方面本发明针对包装细胞中AAV的定量以及病毒纯化过程中中间样品的AAV的定量，优选地使用核酸消化能力强且对待消化体系成分要求不高的Benzonuclease酶，以彻底消除残留转染质粒对滴度测定的影响。优选地Benzonuclease酶消化体系中含2mMMgCl2；

又一方面本发明优化了蛋白酶K消化缓冲液成分，使得复杂成分中的AAV裂解更为充分，让测定结果更为准确。

优选的蛋白酶K消化缓冲液成分PK buffer 1 为ddH2O;

优选的蛋白酶K消化缓冲液成分PK buffer 2 为 30mM Tris-HCl;

优选的蛋白酶K消化缓冲液成分PK buffer 3 为 10mM Tris-HCl, 25mM EDTA,100mM NaCl,0.5%SDS;

优选的蛋白酶K消化缓冲液成分 PK buffer 4 为 10mM Tris-HCl, 100mM EDTA,0.5%SDS。

又一方面本发明针对纯化的AAV的定量使用DNaseI消化，使用线性化的质粒样品作为定量标准品，为了定量的批间稳定性，标准品以较低浓度（标曲定量最上线的10倍浓度）批量分装于特定的储存液中，置于-80℃保存防止样品降解。

又一方面本发明由于标准品以较低浓度（标曲定量最上线的10倍浓度）储存于-80℃，长时间还是会出现降解而导致标曲扩增效率不达标的现象，所以优选地将线性化标准品质粒储存于含100ng变性鲑鱼精DNA的TE缓冲液中（TE缓冲液成分：Tris buffer PH8.0,10mM EDTA)，使得标准品能够长期稳定储存。

又一方面本发明qPCR定量使用目的基因特异性引物，使得AAV滴度定量在无需参照样品AAV校正的情况下CV在25%以内。