[发明专利]一种基于分子探针技术制备乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法

说明书

本发明公开了一种基于分子探针技术制备乳清蛋白‑咖啡酸结合物的方法。本发明利用咖啡酸小分子探针与乳清蛋白结合，通过生物素探针‑链霉亲和素磁珠系统富集、纯化蛋白组，经聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白组进行快速筛选，结果表明活性探针泳道出现特异性条带，可利用小分子探针钓取出乳清蛋白‑咖啡酸的结合物，对咖啡酸与乳清蛋白构效关系的深度研究及二者营养价值的精准把控具有重要意义。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于分子探针技术制备乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法。

背景技术

多酚是水果、蔬菜、茶和咖啡中的主要植物化学物质，具有许多有益的功能特性，如抗氧化、抗炎症、抗过敏性、预防癌症和神经退行性疾病等作用。将多酚引入食品体系，二者的相互作用影响着食品的结构和口感，被视为赋予和提高食品抗氧化性质和生物功能特性的有效途径之一，而蛋白质因具有结合多酚的性质也被视为多酚加入食品体系的良好载体。多酚可以与蛋白质进行非共价相互作用，包括疏水相互作用、氢键和静电相互作用。此外，多酚还可以通过醌、多酚氧化产物和蛋白质侧链或肽链上的亲核残基(硫醇、氨基、胍或咪唑)之间的相互作用与蛋白质进行共价相互作用。

咖啡酸是咖啡饮品中一种重要的酚酸，在抗氧化、预防慢性炎症和心血管疾病等方面发挥重要作用。乳清蛋白是乳制品中重要的蛋白质，不仅具有良好的氨基酸分布和功能性质，还有参与调解人体血糖和脂质代谢、刺激免疫系统等多种生物学活性。目前乳制品及咖啡饮品已成为人类重要的膳食组分，有研究表明，咖啡酸与乳清蛋白结合有效提高了咖啡酸在胃肠道环境中的稳定性，增强了其在人体内的抗氧化活性，同时咖啡酸对乳清蛋白的三维结构具有修饰作用，有望作为降低乳清蛋白致敏性的理想方法，二者的协同作用有助于调节人体生理功能、促进吸收代谢。

然而，尽管咖啡酸与乳清蛋白结合表现出较好的生物学活性，但二者结合物快速有效的调取方法目前尚未有报道，从而极大限制了咖啡酸与乳清蛋白构效关系的深度研究及对二者营养价值的精准把控。因此设计与合成具有生物活性的小分子探针，对进一步研究咖啡酸与乳清蛋白的相互作用具有重要意义。生物素作为一种常见的标记基团，目前未见报道咖啡酸和生物素连接形成咖啡酸-生物素小分子探针，并钓取咖啡酸与乳清蛋白结合物的研究。本研究利用合成的小分子探针，通过聚丙烯凝胶电泳技术，形成了一种制备乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法，为咖啡酸与乳清蛋白相互作用的深度研究提供了有效手段。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种基于分子探针技术制备乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法，以克服现有的乳清蛋白-咖啡酸结合物钓取研究的不足。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明的第一个目的是提供一种咖啡酸-生物素小分子探针，所述小分子探针的结构如式1所示，

本发明的第二个目的是提供前述咖啡酸-生物素小分子探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1：将式2所示化合物、式3所示化合物溶于有机溶剂A中；

室温下加入有机溶剂B、有机溶剂C，反应搅拌；将反应液加入到甲基叔丁基醚中析出中间产物A，用硅胶柱纯化，再用二氯甲烷和石油醚重结晶得到式4所示化合物；

式2所示化合物为

式3所示化合物为

式4所示化合物为

S2：将式4所示化合物溶于二氯甲烷；冰浴下加入盐酸-甲醇溶液，反应搅拌；浓缩反应液得到式5所示化合物；

式5所示化合物为

S3：将式5所示化合物、式6所示化合物溶于有机溶剂A中；室温下加入有机溶剂B、有机溶剂C，反应搅拌；将反应液加入到甲基叔丁基醚中析出中间产物B；用硅胶柱纯化，再用二氯甲烷和乙酸乙酯重结晶得到式1示化合物；