[发明专利]一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法。本发明公开了公开了一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法，包含下列步骤：S1.克隆或合成获得含野生型IMPDH II序列的重组核酸片段；S2.构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；S3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；S4.IMPDH II蛋白纯化。本发明所述方法能能够高效的表达带有8x His标签，TEV酶剪切位点的人野生型IMPDH II蛋白,每升自诱导培养基可收获纯度达90％以上的蛋白350mg以上，比活力可达2左右，置于存储Buffer中，在4℃环境中可存储14天保持活力不降。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法。

背景技术

肌苷-5’-单磷酸脱氢酶(inosine 5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH，EC1.2.1.14)是鸟嘌呤生物合成的限速酶。该酶主要与细胞增殖等相关，抑制该酶活性可抑制肿瘤细胞的增殖，因此，该酶是重要的抗肿瘤药物靶标。表达有活性的IMPDH可应用于其抑制的高通量筛选，有助于抗肿瘤药物的筛选以及药物的作用机制研究。

在人体内主要有两种亚型：IMPDH I和IMPDH II，其中，IMPDH II型特异性的分布于淋巴细胞中，抑制其活性可阻止淋巴细胞的增殖；因此其抑制剂可应用于机体免疫的调节；其抑制剂的应用包括在器官移植后的排异反应控制。表达有活性的IMPDH II蛋白可应用于免疫抑制剂的筛选，有助于排异反应控制药物的筛选和该类药物的作用机制研究。

野生型IMPDH II的核酸序列和蛋白序列已被公开报道【Natsumeda,Y.,etal.1990J BioZ.Chem.265:5292-5295；Collart,F.R.and Hubermann,E.1988J.Biol.Chem.263:15769-15772；and U.S.Pat.No.5,665,583(SEQ ID NO:63)】，野生型IMPDH II的表达主要依赖于原核表达系统和真核表达系统。在有活性的野生型IMPDHII的表达中，原核表达系统主要用到的表达工程菌株包括：IMPDH缺陷型大肠杆菌H712和常规的大肠杆菌；专利EP 1 559 779 A1公开了利用IMPDH酶缺陷型大肠杆菌H712对IMPDH II和其变体进行表达，可表达获得天然的IMPDH II和其变体，但该方法要用到IMPDH缺陷型表达菌株E.coli H712；而常规的大肠杆菌表达野生型IMPDH II，尤其是带有His标签时大都以包涵体形式存在，导致工艺复杂、蛋白活性较低，目前市售的原核表达的IMPDH II绝大部分是包涵体，只能用于SDS-PAGE实验，没有生物学活性。真核表达系统主要用到HeLa稳转株细胞表达，市售的真核表达的IMPDH II相对比活也比较低，且售价较昂贵。

大量生产和纯化野生型IMPDH II的能力对于临床应用和研究应用也很重要，如对新的IMPDH II抑制剂的识别和设计，对癌症和免疫抑制疗法以及检测IMPDH II与抑制剂的灵敏度，因此急需一种表达量高、易于纯化、活性高、稳定性强、成本低的获得天然IMPDH II蛋白的方法，以便推广和应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达量高、易于纯化、活性高、稳定性强、成本低的获得天然IMPDH II蛋白的方法。

本发明公开了一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法，包含下列步骤：

S1.克隆或合成获得含野生型IMPDH II序列的重组核酸片段；

S2.构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；

S3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；

S4.IMPDH II蛋白纯化；