[发明专利]一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法

权利要求书

1.一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法，包含下列步骤：

S1.克隆或合成获得含野生型IMPDH II序列的重组核酸片段；

S2.构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；

S3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；

S4.IMPDH II蛋白纯化；

其特征在于，步骤S3中所述自诱导培养基由下列组分组成：

α-乳糖：2g/L；葡萄糖：0.5g/L；甘油：5g/L；KH₂P0₄：3.4g/L；

MgSO₄：0.49g/L；蛋白胨：10g/L；Na₂HPO₄ 3.55g/L；Na₂SO₄：0.71g/L；

NH₄Cl:2.67g/L；pH 7.4。

2.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组核酸片段含有His标签，其位于IMPDH II核酸序列的N端。

3.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组核酸片段含有TEV酶剪切位点的核酸序列，其位于His标签序列和IMPDH II核酸序列中间。

4.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组载体为pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)或pET-Duet。

5.如权利要求4所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组载体为pET-28a(+)。

6.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述宿主细胞为BL21(DE3)或ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21。

7.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述宿主细胞为ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21。

8.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述自诱导培养条件为温度10-20℃，pH7-8。

9.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述自诱导培养条件为先37℃培养至菌液OD₆₀₀为3.0-4.0，然后12℃继续培养至菌液OD₆₀₀为14-19。

10.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述蛋白纯化步骤：

a.菌体称重

b.按照1g湿菌体加入50ml Buffer A的量重悬菌体并使用均质机破碎细胞

c.使用AKTA Pure蛋白纯化仪和His trap HP预装柱纯化蛋白

d.透析和超滤浓缩蛋白

所用溶液如下：

裂解液：50mM KH₂PO₄,300mM KCl,20mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；

洗脱液：50mM KH₂PO₄,300mM KCl,500mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；

透析液：50mM KH₂PO₄,300mM KCl,1mM DTT,0.8M尿素,1mM EDTA,1mM PMSF,pH8.0。