[发明专利]一种利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法

说明书

本发明公开了一种规模化生产全雌性黄鳍鲷的方法，包括以下步骤：（S1）F0代嵌合体雄鱼的获得；（S2）测交和基因突变个体的筛选；（S3）1龄雌性黄鳍鲷的生产和鉴定。该方法以黄鳍鲷雌雄同体生殖特性为基础，结合性别功能基因nanos2利用和CRISPR/Cas9基因编辑技术，为黄鳍鲷养殖提供遗传改良的新品系或新品种。

技术领域

本发明属于水产动物遗传育种与功能基因利用技术领域，具体涉及一种利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法，尤其是涉及一种利用CRISPR/Cas9基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法。

背景技术

黄鳍鲷（Acanthopagrus latus），属于鲈形目（Perciformes），鲷科（Sparidae），棘鲷属（Acanthopagrus），又称为黄脚立、赤翅、鲛腊鱼、黄鳍鲷。体长椭圆形，扁而窄，体高，头部尖，尾双叉形。黄鳍鲷的分布贯穿印度西太平洋，从波斯湾沿着印度海岸到菲律宾，从澳大利亚到日本，我国主要分布广东、福建、广西等的沿海城市。黄鳍鲷盐度适应能力强，海水、咸淡水均生长良好，所以在养殖业中占有重要地位。黄鳍鲷属于雌雄同体雄性先熟鱼类，没有性染色体，存在性反转现象，1龄和2龄黄鳍鲷全部为功能性雄鱼，直到第三个繁殖季节，才有部分成鱼性逆转为功能性雌鱼。这种性别分化方式和性逆转生殖特点造成了黄鳍鲷生产实践中雌鱼数量缺乏，给黄鳍鲷的人工繁育和遗传改良带来了很大的困难。且黄鳍鲷群体中雌鱼个体比雄鱼大，导致养殖群体中规格不整齐，饲料利用率低。因此，进行黄鳍鲷性别控制技术的研究，生产1龄雌性黄鳍鲷，将大幅提高黄鳍鲷的养殖效率，为下一步培育全雌性黄鳍鲷品系奠定基础。迄今，国内外还没有见到有关黄鳍鲷性别控制技术的研究。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是近年来发展起来基因组定向编辑和改造技术，主要是利用靶向特异的guide RNA，引导Cas9蛋白酶对靶向DNA序列完成特异性切割。该技术操作简单，对基因组切割效率高，目前已在多种鱼类中得到应用，包括斑马鱼、青鳉、黄颡鱼、半滑舌鳎、尼罗罗非鱼、斑点叉尾鮰、白斑狗鱼、虹鳟、鲤鱼、黄鳝等。但是，迄今为止，还没有在黄鳍鲷中实现基因编辑操作。因此，黄鳍鲷的基因功能和遗传改良育种等方面研究进展缓慢。

Nanos2是Nanos基因家族成员之一，可以编码一种保守的RNA结合蛋白，其主要在原始生殖细胞和精原细胞中表达，是一种重要的雄性生殖调控因子。目前，Nanos2已在小鼠、果蝇、斑马鱼、鸡等多个物种中进行了研究，证明nanos2对于雄性的发生和雌性的抑制具有重要的调控作用，但对于雌雄同体鱼类中精卵巢结构发生和发育的影响，还没有报到，仍需进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用基因编辑生产1（岁）龄雌性黄鳍鲷的方法，该方法以黄鳍鲷雌雄同体生殖特性、性别功能基因nanos2利用和CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，为黄鳍鲷养殖提供遗传改良的新品系或新品种。

本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法，包括以下步骤：

（S1）F0代嵌合体雄鱼的获得：利用CRISPR/Cas9基因编辑方法，采用显微注射的方式，将nanos2靶基因的gRNA和Cas9蛋白的mRNA混合物导入黄鳍鲷1细胞期的受精卵的动物极中，孵化后即可获得靶基因突变的F0代嵌合体黄鳍鲷雄鱼；

（S2）测交和基因突变个体的筛选：将步骤（S1）中获得的F0代嵌合体黄鳍鲷雄鱼与野生型雌鱼交配，从后代中筛选具有nanos2有义突变的F1代杂合子个体（nanos2^+/-）；