[发明专利]一种利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法

权利要求书

1.一种利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法，其特征是包括以下步骤：

（S1）F0代嵌合体雄鱼的获得：利用CRISPR/Cas9基因编辑方法，采用显微注射的方式，将nanos2靶基因的gRNA和Cas9蛋白的mRNA混合物导入黄鳍鲷1细胞期的受精卵的动物极中，孵化后即可获得靶基因突变的F0代嵌合体黄鳍鲷雄鱼；

（S2）测交和基因突变个体的筛选：将步骤（S1）中获得的F0代嵌合体黄鳍鲷雄鱼与野生型雌鱼交配，从后代中筛选具有nanos2有义突变的F1代杂合子个体（nanos2^+/-）；

（S3）1龄雌性黄鳍鲷的生产和鉴定：将F1代杂合子个体（nanos2^+/-）养殖到性成熟，其中一部分个体正常发育为杂合子雄鱼（nanos2^+/-），一部分个体自然性逆转为F1代杂合子雌鱼（nanos2^+/-），选取F1代杂合子雌鱼（nanos2^+/-）和F1代杂合子雄鱼（nanos2^+/-）交配，筛选得到F2代纯合子突变体个体（nanos2^-/-），所述F2代纯合子突变体个体（nanos2^-/-）1龄性成熟时，性反转为功能性雌鱼；

步骤（S1）中合成所述nanos2靶基因的gRNA的引物包括正向引物nanos2-gRNA-F和反向引物gRNA-R，所述正向引物nanos2-gRNA-F的序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物gRNA-R的序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法，其特征是：步骤（S1）中所述nanos2靶基因的gRNA和所述Cas9蛋白的终浓度分别为30~40 ng/µL和150~200 ng/µL，每颗受精卵中所述nanos2靶基因的gRNA和Cas9蛋白的mRNA混合物的注射量为1~2nL。

3.根据权利要求1所述利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法，其特征是：步骤（S1）中采用显微注射的方式，将nanos2靶基因的gRNA和Cas9蛋白的mRNA混合物导入黄鳍鲷1细胞期的受精卵的动物极中，需在受精后40分钟内完成注射。

4.根据权利要求1所述利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法，其特征是：步骤（S2）中将F0代嵌合体黄鳍鲷雄鱼与野生型雌鱼按照1：1~2的数量配比交配。

5.根据权利要求1所述利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法，其特征是：步骤（S2）中用于检测具有nanos2有义突变的F1代杂合子个体（nanos2^+/-）的PCR引物，包括正向引物nanos2-F1和反向引物nanos2-R1，其中所述正向引物nanos2-F1的序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物nanos2-R1的序列如SEQ ID NO：4所示。