[发明专利]一种快速广谱检测细菌的试剂盒、制备方法及其检测方法

权利要求书

1.一种快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤C1，收集红细胞膜，形成红细胞膜溶液B；

步骤C2，通过利用吲哚菁绿、聚乳酸-羟基乙酸共聚物与红细胞膜溶液B混合，再通过离心制得近红外荧光纳米球；

步骤C3，制备Fe₃O₄水溶液，加入红细胞膜溶液B，分离制得超顺磁性纳米球；

具体的，所述步骤C2中，将吲哚菁绿溶解于二甲基亚砜形成溶液D，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于丙酮形成溶液E，将所述溶液D和所述溶液E混合形成溶液F；将所述溶液F滴入RO水中形成溶液G，搅拌所述溶液G使二甲基亚砜和丙酮挥发形成溶液H，将所述溶液H透析得到溶液I，将所述溶液I与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合物J，将混合物J用冰浴处理，获得红细胞膜纳米球溶液K；将红细胞膜纳米球溶液K离心得到红细胞纳米球沉淀，再用磷酸缓冲盐溶液分散所述红细胞纳米球沉淀得到溶液L；将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入所述溶液L中形成溶液M，将所述溶液M离心5分钟，得到近红外荧光纳米球；

再具体的，所述步骤C3中，在Fe₃O₄水溶液加入与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合液R；用磁铁收集，用RO水洗涤若干次获得Fe₃O₄红细胞膜纳米球溶液S，将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入Fe₃O₄红细胞膜纳米球溶液S中，通过磁分离收集，得到超顺磁性纳米球；

再具体的，利用D-Ala-N₃实现对革兰氏阳性菌的肽聚糖的叠氮标记，利用Kdo-N₃实现对革兰氏阴性菌的脂多糖的叠氮标记；所述近红外荧光纳米球和磁性纳米球上的DBCO可与细菌表面标记的叠氮基团通过点击反应结合，用于捕获和检测细菌。

2.根据权利要求1所述的快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤C1包括：

采集无菌血，去除血浆、白细胞和血小板后收集得到红细胞沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤红细胞沉淀至上清液澄清，然后悬浮在磷酸缓冲盐溶液中静置，等待红细胞破裂，再离心、收集红细胞膜沉淀，形成红细胞膜溶液B。

3.根据权利要求1所述的快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，

在六水合三氯化铁和柠檬酸三钠的混合物中，再加入乙二醇，然后加入乙酸钠加热溶解，形成混合物N；高压高温后形成沉淀物四氧化三铁；

用乙醇和RO水分别清洗若干次得到Fe₃O₄纳米颗粒溶液P，将Fe₃O₄纳米颗粒溶液P加入到聚乙烯亚胺水溶液中形成溶液Q；再收集Fe₃O₄，将Fe₃O₄重分散至1mL水里，制得Fe₃O₄水溶液。

4.一种快速广谱检测细菌的试剂盒，其特征在于，包括通过权利要求1-3任一制备方法制得的近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球。

5.根据权利要求4所述的快速广谱检测细菌的试剂盒，其特征在于，所述近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球的质量比为3:1。

6.一种非诊断目的的快速广谱检测细菌的方法，其特征在于，先向样品中加入D-Ala-N₃和Kdo-N₃孵育，再使用权利要求5所述的试剂盒与被测样品混合、孵育，再通过透射电镜或荧光显微镜观察近红外荧光纳米球、超顺磁性纳米球捕获的细菌的形态和结合情况，得出检测结果。