[发明专利]一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒及检测方法，属于病原微生物检测技术领域。本发明所述试剂盒包括特异性扩增引物、荧光探针、阳性质控品、阴性质控品和检测试剂，其中，所述特异性扩增引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～NO.2所示；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述阳性质控品为含有耶式肺孢子菌基因保守区域的重组质粒，保守区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明所述试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强，可对复杂生物样本中低丰度的核苷酸进行定性和定量检测的优点，有助于实现临床肺孢子菌肺炎的早期、快速、精确定量检测。

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的引物和探针，以及包含该引物和探针的试剂盒及检测方法。

背景技术

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)是临床上常见的呼吸道系统疾病，主要发生在免疫功能低下者，如虚弱的早产儿、获得性免疫缺陷综合征患者、恶性肿瘤或血液病患者化疗后以及长期使用免疫抑制药物的患者等免疫功能低下的人群。PCP是艾滋病患者最重要的机会性感染，预期病死率为5％～30％，是导致艾滋病患者死亡的重要因素之一。根据来源不同，肺孢子菌分为5种：人的耶氏肺孢子菌、大鼠的卡式肺孢子菌、小鼠源肺孢子菌、大鼠源肺孢子菌、兔源肺孢子菌。其中，耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii,Pj)在环境中普遍存在，可以引起人类呼吸系统感染，是导致肺孢子菌肺炎的主要病原菌，是免疫缺陷患者重要的条件致病病原体，它们通常寄生在患者的肺泡中，依赖肺部环境获取营养物质，具有逃避宿主先天性免疫和适应性免疫的能力，临床表现与体征不明显，疾病进展迅速，造成患者肺功能加速恶化，病死率较高，然而早期诊断却非常困难。

目前临床上检测病原菌的常规方法包括：1)呼吸道标本涂片染色镜检法；2)体外菌体培养鉴定法；3)组织病理学检测法；4)血清学检测法；5)PCR或qPCR检测法；6)环介导等温扩增(LAMP)法。大量实验表明，耶氏肺泡子菌适应人体肺部生存环境，可以在肺泡细胞表面生存，却不能在常规的培养基上生长。因此，很难通过体外培养菌体后进行常规的检测分析及药物筛选等。而且在感染初期耶氏肺孢子菌含量很低，又位于下呼吸道感染，难于采样及确诊，容易延误病情。随着分子诊断技术的快速发展，基于PCR技术的检测方法层出不穷，例如实时定量PCR技术、多位点序列分型技术、限制性片段长度多态性分析技术、环介导等温扩增技术等。尽管这些技术在临床病原菌检测中发挥了重要的作用，然而却不能有效的从复杂样本中检测微量核酸拷贝数，尤其是耶氏肺孢子菌的检测，至今还是依赖传统的影像学和病理学检测手段。因此急需建立一种高效灵敏、准确可靠的分子诊断方法，为肺孢子菌肺炎的早期诊疗提供科学依据。

发明内容

鉴于此，本发明建立了一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒及检测方法，具有特异性好，检测灵敏度高，抗干扰能力强的特点，突破了复杂生物样本中痕量耶式肺孢子菌定性或定量检测的技术瓶颈问题。

本发明目的是通过以下方式实现：

本发明提供一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增引物和荧光探针，其中，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

基于上述技术方案，进一步地，荧光探针类型为TaqMan探针或TaqMan-MGB探针；荧光探针的5’端和3’端分别修饰荧光基团和淬灭基团，其中，修饰5’端的荧光基团选自：FAM,HEX,TET,JOE,VIC,ROX,Cy3或Cy5，修饰3’端的淬灭基团选自：TAMRA、MGB、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

基于上述技术方案，进一步地，所述荧光探针的5’端的荧光基团为HEX,3’端的淬灭基团为MGB。