[发明专利]一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增引物和荧光探针，其中，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，荧光探针类型为TaqMan探针或TaqMan-MGB探针,荧光探针的5’端和3’端分别修饰有荧光基团和淬灭基团，其中，修饰5’端的荧光基团选自：FAM,HEX,TET,JOE,VIC,ROX,Cy3或Cy5，修饰3’端的淬灭基团选自：TAMRA、MGB、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品以及无菌水。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品是含有耶式肺孢子菌基因保守区域的重组质粒，所述的重组质粒中载体骨架为PUC57，所述的耶式肺孢子菌基因保守区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；阴性质控品为TE缓冲液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品的构建方法如下：人工合成耶式肺孢子菌基因保守区域的核苷酸片段，通过TA克隆连接到PUC57载体上，进行大肠杆菌热转化、提取质粒，测序验证核苷酸序列，得到重组质粒。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、缓冲液。

7.一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的检测方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)对待检样品进行预处理，然后使用核酸提取试剂盒提取DNA模板，使用权利要求1～6任一项所述的试剂盒配制包含正向引物、反向引物、荧光探针、DNA模板的混合溶液；

(2)利用PCR微滴生成仪将步骤(1)制备的混合溶液生成微滴，再利用微滴数字PCR仪进行扩增，PCR反应结束后利用微滴分析仪读取DNA拷贝数，获得定性或定量结果。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述样本包括痰液、口咽拭子、肺泡灌洗液、血液、组织提取液或排泄物。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合溶液中正向引物和反向引物的摩尔浓度均为100～1000nM，荧光探针的摩尔浓度为50～500nmol/L。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的微滴数字PCR仪的扩增程序为：95～98℃预变性2～10分钟，95～98℃变性30～60秒，50～60℃退火并延伸30～60秒，循环30～50次，90～100℃微滴固化5～15分钟。