[发明专利]一种制备L-草铵膦的方法

说明书

本发明提供了一种利用谷氨酸脱氢酶制备L‑草铵膦的方法，包括如下步骤：以4‑(羟基‑(甲基)氧膦基)‑2‑氧代丁酸为底物，在氨基供体存在下，使用谷氨酸脱氢酶SEQ ID NO:2或者其V375突变体催化不对称还原胺化反应，得到L‑草铵膦。本发明还公开了一种合成底物4‑(羟基‑(甲基)氧膦基)‑2‑氧代丁酸的新方法。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用谷氨酸脱氢酶催化制备L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦是世界第二大转基因作物耐受的广谱非选择性除草剂，化学名为2-氨基-4[羟基-(甲基)膦酰基]-丁酸，是一种谷氨酰胺合成酶抑制剂。目前，世界上的三大非选择性除草剂分别为草甘膦、草铵膦和百草枯。近年来，随着草甘膦的大规模使用以及抗草甘膦作物的推广种植，杂草对草甘膦的抗性也逐渐增强。而百草枯由于毒性极强导致在全球范围陆续被禁用。随着转基因作物推广种植，且草铵膦的抗性基因陆续被导入各种作物中，草铵膦在未来一段时间内市场需求巨大，前景非常广阔。草铵膦存在两种对映异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦，市场销售的一般为外消旋的草铵膦。但仅L-草铵膦具有除草活性，除草谱广，其活性接近于消旋体的两倍，并且L-草铵膦在土壤中易分解，对人类和动物造成的毒性较小，对环境破坏力小。

使用光学纯的L-草铵膦，不仅能够减少施药量，而且可以有效减缓杂草抗性增长、减轻环境负担，并且降低运输储存需求，具有显而易见的经济和环境优势，更符合现代环保理念。

目前L-草铵膦的制备方法主要有以下三种：手性拆分法、化学合成法以及生物催化合成法。其中，手性拆分法存在以下缺点：需要使用昂贵的手性拆分试剂，理论收率只有50％，工艺繁琐复杂。化学合成法虽然开发了很多路线，但依然存在着很多弊端，如前体去氢氨基酸不对称加氢制备L-草铵膦需要用到较为昂贵的手性催化剂(Journal of OrganicChemistry,1991,56,1783-1788；Pesticide Science,2014,41,269-277)；不对称Strecker反应制备L-草铵膦需用到氰化物，且催化剂用量较高，反应条件苛刻(WO2008035687；Chemical Reviews,2011,111,6947-6983)；不对称Michael加成反应制备L-草铵膦的立体选择性不理想(CN105131032A；Bulletin of the Chemical Society of Japan,1987,60,1761-1766)，因此这些过程多见于实验室研究中，不易放大生产。

与化学合成法相比，生物催化法具有立体选择性专一、反应条件温和、收率高等优点。已经有多条酶法制备L-草铵膦的工艺报道。其中，以酮酸4-(羟基-(甲基)氧膦基)-2-氧代丁酸(PPO)为底物，通过谷氨酸脱氢酶催化不对称还原胺化合成L-草铵膦前体的工艺路线是比较有潜力。其中，涉及的谷氨酸脱氢酶在生物体内几乎无所不在，可以可逆地催化谷氨酸氧化脱氨生成α-酮戊二酸。与采用转氨酶的L-草铵膦酶法制备工艺相比，利用谷氨酸脱氢酶催化PPO还原胺化制备L-草铵膦具有两个显著的优点：一是当辅酶再生系统效率较高时，底物能够100％地转化生成L-草铵膦；二是利用无机铵作为氨基供体，不会产生难以分离的副产物，因此产物易于提纯精制。专利文献CN106978453A采用谷氨酸脱氢酶催化不对称还原胺化合成了L-草铵膦：

但在该报道中，酶催化底物浓度低，仅为10～100mM，催化效率不高，表明使用的谷氨酸脱氢酶存在底物抑制性和/或产物抑制性。因此有必要开发高活性、高底物耐受性的谷氨酸脱氢酶。

谷氨酸脱氢酶催化合成L-草铵膦需要以酮酸PPO为底物，该底物的绿色、经济合成决定着整条工艺产业化的环保性和工业可行性性。专利文献CN103665032A中公开了一种该前体酮酸的合成方法，利用环磷酸酐与氰化物反应获得酮腈，进而氰基水解得到酮酸中间体。由于该工艺使用了剧毒氰化物，因此危险性大，并且该反应的第一步不易实现。