[发明专利]一种制备L-草铵膦的方法

权利要求书

1.一种制备L-草铵膦的方法，其特征在于，包括如下步骤：以4-(羟基-(甲基)氧膦基)-2-氧代丁酸为底物，在氨基供体存在下，使用氨基酸序列为SEQ ID NO:2的谷氨酸脱氢酶或者其V375突变体催化不对称还原胺化反应，得到L-草铵膦，其中所述V375突变体选自下组：

V375S突变体即SEQ ID NO:3，V375A突变体即SEQ ID NO:4，V375G突变体即SEQ ID NO:5，V375C突变体即SEQ ID NO:6。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基供体为硫酸铵、磷酸氢二铵、碳酸氢铵、硝酸铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵或氨水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中添加有辅酶再生系统，所述辅酶再生系统选自下组：

(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，包含NADPH或NADP⁺的葡萄糖脱氢酶再生系统；

(2)以异丙醇为辅酶再生底物、以醇脱氢酶为辅酶再生酶，包含NADPH或NADP⁺的醇脱氢酶再生系统；

(3)以甲酸盐为辅酶再生底物、以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶，构成包含NADPH或NADP⁺的甲酸脱氢酶再生系统。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中，所述谷氨酸脱氢酶或者其V375突变体呈酶形式或者呈表达所述酶的微生物菌体形式添加。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，底物4-(羟基-(甲基)氧膦基)-2-氧代丁酸通过下述工艺制备：

将式III所示4-(乙氧基-(甲基)膦酰基)-2-氧代丁酸酯与浓盐酸反应脱保护，得到式IV所示底物，

其中，R选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、苯甲基。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，式III所示化合物通过下述工艺制备：

(1)将二氢-2,3-呋喃二酮(式I)加入到氢溴酸的醋酸溶液中，于60～80℃反应至产物不再继续增加，加入醇类试剂，继续搅拌一定时间至反应终止，得到4-溴-2-氧代丁酸酯(式II)；

(2)在氮气保护下，将4-溴-2-氧代丁酸酯(式II)与甲基亚磷酸二乙酯混合，加热至100～200℃反应直至产物不再继续增加，得到4-(乙氧基-(甲基)膦酰基)-2-氧代丁酸酯(式III)，

其中，R选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、苯甲基。

7.一种微生物，其特征在于，其表达如权利要求1中所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:3-6中一种的谷氨酸脱氢酶。

8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，还同时表达如权利要求3中所述的辅酶再生酶。

9.如权利要求7或8所述的微生物在制备L-草铵膦中的用途。