[发明专利]一种DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用。所述试剂盒包括P7接头和P5接头，所述P7接头由反向互补的第一链和第二链组成，所述第一链5’端具有修饰基团，所述修饰基团包括磷酸基团、羟基或腺苷，所述第一链3’端经封闭修饰，所述封闭修饰包括C6氨基修饰、C12氨基修饰、双脱氧修饰或spacer修饰，所述第二链的3’端经封闭修饰，所述封闭修饰包括双脱氧修饰。本发明对P7接头和P5接头进行设计及特殊修饰，并组合使用，能够使其实现全新的连接模式，从而显著提高连接效率及试剂盒的灵敏性，进而提高建库效率。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用。

背景技术

目前，通常采用建库试剂盒(例如illumina、Roche、NEB等厂商提供的建库试剂盒)进行构建文库，且构建文库的主要流程包括：1.将大片段的DNA打断成为长度200～500bp的DNA片段；2.将片段化的DNA进行末端修复，形成两端的平末端；3.使用聚合酶的末端转移酶活性在DNA片段的3’末端加A碱基；4.使用带有3’末端T碱基的双链Y字型接头与将带有3’A末端的dsDNA杂交后连接；5.将连接上接头的产物进行PCR富集获得可以上机测序的文库。

如CN112708939A公开了一种构建DNA文库的试剂盒及方法，其中试剂盒包括混合酶液、混合缓冲液、连接酶和连接缓冲液，混合酶液包含核酸内切酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶，混合缓冲液和连接缓冲液包含DTT和PEG 8000，混合酶液和混合缓冲液用于形成第一反应体系，连接酶和连接缓冲液用于形成第二反应体系，测序接头为Y字型接头，所述Y字型接头由P5端接头序列与P7端接头序列退火而形成，所述P5端接头序列的3'端最后两位碱基之间的连接键经硫代修饰，所述P7端接头序列的5'端第一位碱基经磷酸化修饰。

然而，目前市面上常见的接头连接方式是TA连接，双链DNA的四个末端需要同时并且分别与接头进行连接，任何一个末端未连接成功，则该条模板链就不能被扩增成可以测序的文库；按照每个末端的连接效率为90％效率评估，文库模板的连接效率最高仅可达60～70％的效率。

综上所述，提供一种高效的文库构建试剂盒对于基因测序领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用，本申请的特设计接头试剂，对P7接头盒P5接头进行特殊修饰，组合使用，并采用全新接头连接模式，能够有效提高连接效率以及建库效率。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种DNA文库构建试剂盒，所述试剂盒包括P7接头和P5接头，所述P7接头由反向互补的第一链和第二链组成，所述第一链5’端具有修饰基团，所述修饰基团包括磷酸基团、羟基或腺苷酰化修饰基团；所述第二链的3’端经封闭修饰，所述封闭修饰包括双脱氧修饰，所述P5接头由单链组成，P5接头的5’末端修饰有羟基基团，3’末端修饰有羟基基团，且3’末端两个碱基之间包含至少一个硫代修饰。

本发明中，对P7接头(P7 Truncated Adapter)和P5接头(P5 Truncated Adapter)进行特殊修饰，并组合使用，能够使其实现全新的连接模式，从而显著提高连接效率，进而提高建库效率。

优选地，所述P7接头的第一链的核酸序列包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列。

优选地，所述P7接头的第二链的dT碱基全部替换成为dU碱基。

优选地，所述P7接头的第二链的序列由核糖核酸组成。