[发明专利]检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合、引物组合、试剂、试剂盒及方法和应用

说明书

本申请属于生物技术领域，公开了检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合、引物组合、试剂、试剂盒及方法和应用，所述双靶标组合为非洲猪瘟病毒的B646L基因和P1192R基因，所述引物组合如SEQ ID NO.1~12所示。采用本申请引物组合基于RT‑LAMP检测体系可快速检测样本中的非洲猪瘟病毒，具有检出限低，特异性好的优点，且降低了核酸检测的技术门槛，普通人经过简单培训便能进行操作满足对病毒的核酸检测。

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体设计一种检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合、引物组合、试剂、试剂盒及方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)引起的烈性传染病，主要感染家猪和各种野猪，感染后会出现发热、心跳加快、呼吸困难等症状，发病时间短，急性致死率高达100％，是重点防范的一类动物疫情。且非洲猪瘟的传播方式复杂，可通过病猪之间接触迅速传播，也可能因为接触携带病毒的人或设备而感染猪群。同时非洲猪瘟病毒的存活能力极强，在生肉熏肉中也可存活3-6个月，猪肉产品、食物残渣等都可能是重要的污染源。因此一旦出现非洲猪瘟的感染，需要立即进行大量样本的检测，但非洲猪瘟的临床症状与猪瘟症状相似，一般的临床检测无法进行区分，只能依靠实验室进行分析检测确诊。

现有的实验室检测方法主要有血清学方法和病原学方法。血清学检测方法主要有间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验等。病原学方法主要以样本内脏血液、口腔粘液等进行的普通PCR和荧光PCR核酸检测方法，但是传统PCR检测要求较高，需要价格高昂的设备和专业的操作技术人员，且检测时间长，不利于大规模的检测，目前仅是作为实验研究使用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi T于2000年发明的一种新的DNA扩增技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。同时为了提高反应速度，还可以通过引入两条环引物加快反应，环引物与合成过程中形成的环状区域互补，增加了在LAMP反应中DNA合成的起点数量，可大大缩短检测时间，提高检测效率。该技术除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

但是目前针对非洲猪瘟病毒引起的非洲猪瘟均是以单个病毒基因作为检测靶标，经常出现漏检导致的假阴性结果，因此针对非洲猪瘟病毒单个病毒基因的检出限在日常使用中还存在不准确的缺陷。

发明内容

针对现有单个病毒基因LAMP反应检测非洲猪瘟病毒经常出现漏检导致的假阴性缺陷，本申请构建了一种针对非洲猪瘟病毒的双靶点RT-LAMP检测体系。

为了实现本申请的技术目的，本申请主要包括以下技术内容：

作为本申请的一个实施方案，提供了一种检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合，所述双靶标组合为非洲猪瘟病毒的B646L基因和P1192R基因。

所述B646L基因在NCBI中非洲猪瘟病毒序列(MK128995.1,21-JUL-2021)的起止位点为：103607-105547，所述P1192R基因在NCBI中非洲猪瘟病毒序列(MK128995.1,21-JUL-2021)的起止位点为：147556-151134。