[发明专利]一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法，该方法为：制备KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物，最终HindIII/BglII双酶切中间载体pGL‑35S‑35S‑mCherry的回收产物，得到pBiflu荧光标签表达载体，还提供了应用，用于植物原生质体的转化，基因启动子转录活力的检测。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用。

背景技术

黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein，YFP)是将绿色荧光蛋白(GFP)第203为苏氨酸突变体为色氨酸，可以稳定生色团在激发状态的偶极矩，使GFP的激发光和发射光波长均增加20nm。而增强型黄色荧光蛋白EYFP是YFP进一步改造成的增强黄色荧光蛋白，激发波长为514nm，发射波长为527nm。相对于YFP，EYFP荧光强度更强、荧光性质更稳定，是目前应用最为广泛的荧光蛋白之一。

mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚的红色荧光蛋白，被广泛用于标记和示踪某些分子和细胞组分。mCherry可以和其他荧光蛋白共同标记，且mCherry相对于其他单体荧光蛋白，具有卓越的光稳定性。mCherry的最大激发光为587nm，发射光为610nm，其对光致漂白耐受，荧光非常稳定。mCherry具有较快成熟速度，t0.5为15min，这在一些需要做出快速反应的实验非常重要，如启动子活性报告系统等。

荧光蛋白的主要应用包括：①活细胞标记：与荧光素/荧光素酶不同，荧光蛋白无需任何辅助因子，只需相应激光照射便能自发光；且荧光蛋白毒性较弱，适合标记活体细胞及组织。②作为报告基因和融合标签：将荧光蛋白基因连接到目的基因启动子后，通过检测荧光强度便可对该基因表达水平进行评估；或者将荧光蛋白作为标签，与目的蛋白融合表达，可用于目的蛋白表达定位、迁移、构象变化及分子相互作用检测。③荧光蛋白用于细胞筛选：将待分离细胞用不同荧光标记，通过流式细胞术富集同种荧光标记的细胞。

目前，用于检测基因启动子转录活性的方法是双荧光素酶报告基因系统，该系统是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，将目的基因转录原件克隆在萤火虫荧光素酶基因上游，构建荧光素酶报告质粒，转染细胞，通过荧光素酶活性高低评价转录活性。为了减少内在变化因素对实验的影响，同时转染带有海肾荧光素酶基因的质粒作为对照质粒，使结果不受实验条件变化的干扰。该系统用于基因转录活性检测存在许多缺陷：①两个质粒同时转染难以保证各组别间两质粒转染效率的同步，实验重复性不好。②双荧光素酶系统检测信号时需要破碎细胞或组织，无法在活细胞或组织内检测。③目前市面上的双荧光素酶报告基因检测试剂盒昂贵，且没有专门用于植物原生质体的检测质粒。

因此，在实际分子生物学研究中急需一种能用于植物原生质体检测基因转录活性的双荧光报告载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用，该pBiflu荧光标签表达载体可用于原生质体中基因启动子转录活力的检测。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法，该方法为：

S1、在温度为37℃的条件下，用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体6h，1％琼脂糖凝胶分离，回收4.8Kb大小的条带，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物；

S2、以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，用特异性引物F1和特异性引物R1进行PCR反应克隆2×35S启动子，将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子PCR回收产物；

所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F1 1μL、特异性引物R1 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；