[发明专利]一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法，其特征在于，该方法为：

S1、在温度为37℃的条件下，用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体6h，1％琼脂糖凝胶分离，回收4.8Kb大小的条带，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物；

S2、以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，用特异性引物F1和特异性引物R1进行PCR反应克隆2×35S启动子，将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子PCR回收产物；

所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F1 1μL、特异性引物R1 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；

所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，扩增40个循环；68℃延伸10min；

所述特异性引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述特异性引物R1核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

S3、利用同源重组方法将S2中得到的2×35S启动子PCR回收产物连接至S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的KpnI/XhoI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S连接产物，将所述pGL-35S连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S；

S4、在温度为37℃的条件下，将S3中得到的中间载体pGL-35S用XhoI/SalI双酶切6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.67Kb大小的条带，得到XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物；

S5、人工合成多克隆位点MCS正向引物和多克隆位点MCS反向引物，将所述多克隆位点MCS正向引物和所述多克隆位点MCS反向引物在95℃的条件下退火5min，得到MCS退火引物；

所述多克隆位点MCS正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述多克隆位点MCS反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

S6、将S5中得到的MCS退火引物T4连接至S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物的XhoI/SalI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-MCS连接产物；将所述pGL-35S-MCS连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS；

S7、克隆Nos Ter序列：以pCambia1302质粒为模板，以特异性引物F2和特异性引物R2为引物进行PCR反应克隆Nos Ter序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收251bp大小的PCR产物，得到Nos Ter序列PCR回收产物；

所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F2 1μL、特异性引物R2 1μL、pCambia1302质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；

所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，扩增40个循环；68℃延伸10min；

所述特异性引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述特异性引物R2核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

S8、将S6中得到的中间载体pGL-35S-MCS用EcoRI/SalI双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.72Kb大小的产物，得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物；

S9、利用同源重组方法将S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物中的Nos Ter序列连接至S8中得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的EcoRI/SalI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S-MCS-Nos连接产物，将所述pGL-35S-MCS-Nos连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS-Nos；

S10、将S9中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Nos用EcoRI/BamHI双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.97Kb大小的产物，得到EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物；

S11、克隆mCherry序列：以pmR-mCherry质粒为模板，以特异性引物F3和特异性引物R3为引物进行PCR反应克隆mCherry序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收711bp大小的PCR产物，得到mCherry序列的PCR回收产物；

所述PCR反应的体系为：2×KOD Master Mix 10μL，特异性引物F3 1μL、特异性引物R31μL、pmR-mCherry质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；

所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；

所述特异性引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述特异性引物R3核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

S12、将S11中得到的mCherry序列的PCR回收产物的mCherry序列T4连接至S10中得到的EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的EcoRI/BamHI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-mCherry连接产物；将所述pGL-35S-mCherry连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-mCherry；

S13、克隆2×35S启动子序列：以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，以特异性引物F4和特异性引物R4为引物进行PCR反应克隆2×35S启动子序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子序列PCR回收产物；

所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F4 1μL、特异性引物R4 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；

所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；

所述特异性引物F4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

所述特异性引物R4核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

S14、将S12中得到的中间载体pGL-35S-mCherry用BamHI/BglII双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.67Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物；

S15、将S13中得到的2×35S启动子序列PCR回收产物的2×35S启动子序列T4连接至S14中得到的到BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物的BamHI/BglII位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-35S-mCherry连接产物；将所述pGL-35S-35S-mCherry连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-35S-mCherry；

S16、克隆EYFP-Nos序列：以pYFPLT质粒为模板，以特异性引物F5和特异性引物R5为引物进行PCR反应克隆EYFP-Nos序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收965bp大小的PCR产物，得到EYFP-Nos序列PCR回收产物；

所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F5 1μL、特异性引物R5 1μL、pYFPLT质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；

所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸30s，扩增40个循环；68℃延伸10min；

所述特异性引物F5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

所述特异性引物R5核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

S17、将S15中得到的中间载体pGL-35S-35S-mCherry用HindIII/BglII双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下5.51Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物；

S18、将S16中得到的EYFP-Nos序列PCR回收产物同源重组至S17中得到的HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物的HindIII/BglII位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pBiflu荧光标签表达载体连接产物；将所述pBiflu荧光标签表达载体连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到pBiflu荧光标签表达载体，命名为pBiflu荧光标签表达载体；所述pBiflu荧光标签表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。