[发明专利]一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针及方法

说明书

本发明公开了一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针及方法，包括检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP‑1，超分支滚环扩增引物组RCA‑F和RCA‑R以及检测扩增产物所用sgRNA，所述检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP‑1，超分支滚环扩增引物组RCA‑F和RCA‑R均为单链DNA；所述锁式探针PLP‑1的核苷酸碱基序列为SEQIDNo.1所示，其中5’端具备磷酸化修饰；所述超分支滚环扩增引物组包含2条引物，核苷酸碱基序列分别为为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。本发明将锁式探针、超分支滚环扩增反应和CRISPR/Cas12技术联用，可以检测长度低至50nt、高度降解的碎片化病毒RNA中所含有的点突变，操作简单，灵敏度高，反应时间短。

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，具体为一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针及方法。

背景技术

新冠病毒属于单链正义RNA病毒，在复制过程中十分容易发生突变。目前世界卫生组织认定需要关注的变异毒株有“阿尔法” (Alpha)、“贝塔”(Beta)、伽玛”(Gamma)、“德尔塔”(Delta)和“奥密克戎”(Omicron)等。这些突变株与新冠病毒原始毒株相比，传染性和毒性都发生了很大改变。奥密克戎(Omicron)突变株是目前突变最多、最传染力最强的新冠病毒变异株，其刺突蛋白(S蛋白)至少包含32个突变位点，其中，H655Y、N679K和P681H突变会增强刺突蛋白的切割和与宿主细胞的融合，可能与传播性增加有关；如何在病毒核酸检测时快速区分这些突变位点，一直是研究者关注的重要问题。

新冠病毒的遗传物质为单链RNA，相对双链DNA而言更加不稳定，当采样、核酸提取和保存过程中操作不当，或存在核酸酶、酸、碱等物质时，很容易降解，断裂为小片段。

目前主流的核酸点突变检测手段包括探针法荧光定量PCR和测序法。测序法最为准确，但耗时较长，不利于临床快速检测；探针法荧光定量PCR检测RNA病毒上的点突变，首先需要将病毒RNA逆转录为cDNA，然后使用一对根据突变位点上下游设计的PCR引物，以及一条覆盖突变位点的Taqman-MGB荧光探针进行荧光定量PCR；由于Taqman探针需要设计在两条引物之间，探针法荧光定量PCR需要的模板长度一般不低于100nt，如果病毒核酸在提取和保存过程中受到破坏，碎片化程度较严重，则难以检测。

发明内容

本发明的目的是提供一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针，包括检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP-1，超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R以及检测扩增产物所用 sgRNA，所述检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP-1，超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R均为单链DNA；所述锁式探针PLP-1的核苷酸碱基序列为SEQ IDNo.1所示，其中5’端具备磷酸化修饰；所述超分支滚环扩增引物组包含2条引物，核苷酸碱基序列分别为为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

作为本发明的一种优选技术方案，所述检测扩增产物所用sgRNA 的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.4。

一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，具体步骤如下：

步骤一：获取病毒RNA；

步骤二：以步骤一获取的RNA为模板，加入锁式探针PLP-1和连接酶，配制连接反应混合液，进行连接反应；

步骤三：使用超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R和具备链置换活性的DNA聚合酶对步骤二的反应产物进行滚环扩增反应；

步骤四：检测扩增产物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤二中的连接反应中，所用的连接酶是Splint R ligase。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤三中的滚环扩增反应中，所用的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。