[发明专利]一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白

说明书

本发明公开了一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70‑P113融合蛋白，由绵羊肺炎支原体热休克蛋白基因HSP70和绵羊肺炎支原体黏附素基因P113拼接而成的融合基因所编码，其氨基酸序列为SQE ID NO.2所示的序列。Western Blot试验证明，该绵羊肺炎支原体HSP70‑P113融合蛋白具有免疫原性，可用于制备绵羊肺炎支原体亚单位疫苗。

技术领域

本发明属于重组蛋白技术领域，具体涉及一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白。

背景技术

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Movi）是引起绵羊和山羊的支原体性肺炎的主要病原之一，呈世界性分布，给世界羊养殖业带来了巨大经济损失。绵羊肺炎支原体的治疗以抗生素为主，然而抗生素导致的耐药性使得绵羊肺炎支原体的治疗效果不理想，所以绵羊肺炎支原体应以预防为主。然而目前国内Movi的疫苗主要是灭活苗，以全菌抗原灭活为主。然而，不同地方流行的支原体具有遗传多样性，菌株之间交叉保护力低，另外Movi体外培养产量相对较低，耗时，全菌抗原存在安全隐患，所以研发高效、安全的Movi新型疫苗是近年的趋势。亚单位疫苗存在安全性高，无核酸、不散毒、不返强，而且抗原组分单一、纯度高，疫苗产量高等优点已成为疫苗发展的趋势。而绵羊肺炎支原体（Movi）还未有商品化亚单位疫苗。目前许多研究集中在通过抗原表位鉴定筛选具有良好免疫原性的蛋白，用于制备亚单位疫苗。P113为黏附素，黏附素是支原体重要的毒力因子也是最为重要的免疫原，是引起机体产生免疫应答的主要蛋白，热休克蛋白HSP70是机体内高度保守的生物分子，也是Movi重要的膜蛋白，具有免疫原性和免疫佐剂效应，其C末端抗原性优势明显，可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫反应。本发明通过筛选HSP70基因以及MO ATCC 29419分离株的P113基因中的优势抗原区域，将两个优势抗原区域的基因序列进行稀有密码子优化，并在两个基因序列中间加上连接子（GGGGSGGGGS），再复制到pET-30a(+)原核表达载体上，命名为HSP70-P113- pET-30a(+)。经过诱导表达，纯化蛋白，免疫小鼠，通过Western Blot试验证明HSP70-P113重组蛋白有免疫原性，可为绵羊肺炎支原体亚单位疫苗的开展提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白，所述的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白的氨基酸序列为SQE ID NO.2所示的序列。

一种编码上述的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白的融合基因，所述的融合基因为使用连接子（GGGGSGGGGS）将绵羊肺炎支原体热休克蛋白基因HSP70和绵羊肺炎支原体黏附素基因P113拼接而成，其核苷酸序列为SQE ID NO.1所示的序列。

一种大肠杆菌表达质粒载体，所述的质粒载体是由上述的融合基因插入至质粒pET-30a的Nde I和BamH I位点之间来构建的，所述的大肠杆菌是BL21（DE3）。

一种用于生产上述的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白的大肠杆菌菌株，所述的大肠杆菌菌株含有上述的质粒载体，所述的大肠杆菌为BL21（DE3）。

一种制备上述的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白的方法，包括以下步骤：

1）将序列如SQE ID NO.1所示的融合基因插入大肠杆菌质粒pET-30a的Nde I和BamH I位点之间，将该质粒转化大肠杆菌获得含有HSP70-P113-pET-30a(+)的菌株，接种培养，IPTG诱导表达；