[发明专利]D-赖氨酸衍生物构筑的细菌细胞壁新生肽聚糖的生物发光检测体系及应用方法

说明书

本发明涉及一种D‑赖氨酸衍生物构筑的细菌细胞壁新生肽聚糖的生物发光检测体系及应用方法，体系包括D‑荧光素衍生物和D‑赖氨酸衍生物。本发明所涉及的荧光素衍生物和氨基酸衍生物，合成方法简单，可以实现利用生物发光技术检测细菌细胞壁中的新生肽聚糖，以及在小鼠体内对细菌进行生物发光检测。合成方法简单，可以利用荧光素酶，在细菌、小鼠活体中对细胞壁中的新生肽聚糖进行检测。识别不会受到环境中共存离子的干扰，具有非常高的选择性。可以与荧光素衍生物发生特异性点击反应，利用荧光素酶进行生物发光检测，具有高灵敏度、特异性和组织穿透力。

技术领域

本发明涉及一种D-赖氨酸衍生物构筑的细菌细胞壁新生肽聚糖的生物发光检测体系及应用方法。

背景技术

细菌细胞壁由膜层和一种称为肽聚糖的刚性而柔软的支架组成。肽聚糖提供机械强度，使细菌能够抵抗环境的破坏和因内部膨胀而产生的溶解。肽聚糖在维持细菌细胞形态方面也起着关键作用。肽聚糖对于细菌繁殖作用、以及作为抗生素靶标的价值，引起了人们对肽聚糖生物合成研究的新兴趣。然而，在对肽聚糖的合成和动力学有一个清晰的了解之前，仍然存在着重大的知识缺口须加以解决。荧光分子探针和成像技术的出现大大推进了肽聚糖合成和修饰的研究。然而，由于荧光分子探针检测需要外源激发光激发，使成像背景信号高，且荧光成像光漂白严重，组织穿透力差，很难对活体进行有效检测。

生物发光检测技术方法简单、信噪比高、组织穿透力强、灵敏度高，已成为发展快速检测各种物种的有效手段之一。目前，关于肽聚糖的检测的荧光探针化合物已经有诸多报道，但还没有利用生物发光探针对细菌、活体肽聚糖进行检测的报道。因此，设计一种生物发光探针对细菌细胞壁肽聚糖进行检测显然具有重要价值。

发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种D-赖氨酸衍生物构筑的细菌细胞壁新生肽聚糖的生物发光检测体系，提供一种细菌细胞壁新生肽聚糖的生物发光检测体系的制备方法，以及用于细菌、活体对肽聚糖进行检。

技术方案

一种D-赖氨酸衍生物构筑的细菌细胞壁新生肽聚糖的生物发光检测体系，其特征在于：体系包括D-荧光素衍生物和D-赖氨酸衍生物的混合物。

所述D-荧光素衍生物和D-赖氨酸衍生物的比例范围为1:1～20。

一种所述体系中的D-赖氨酸衍生物，其特征在于结构式为：

一种所述D-赖氨酸衍生物的制备方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：将4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸置于二氯甲烷中，室温下逐滴滴加草酰氯，加入催化量的DMF，室温搅拌1～12h，蒸干得到粗品4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯甲酰；

所述4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸与草酰氯摩尔比1:2；

步骤2：将粗品4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯甲酰氯溶解于干燥的四氢呋喃中，并将其滴加至到N-(叔丁氧羰基)-D-赖氨酸、碳酸氢钾水溶液中；室温搅拌过夜，浓缩以去除四氢呋喃；

所述4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸与N-(叔丁氧羰基)-D-赖氨酸摩尔比1:2，4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸与碳酸氢钾摩尔比1:2-5；

步骤3：柱层析分离步骤2得到的中间体，将其溶于少量乙酸乙酯中，加入饱和氯化氢乙酸乙酯溶液脱Boc，此时有白色固体析出，过滤收集白色固体得到D-赖氨酸衍生物DAz。

一种所述体系中的D-荧光素衍生物，其特征在于：所述D-荧光素衍生物结构式为：

一种所述D-荧光素衍生物的制备方法，其特征在于步骤如下：