[发明专利]利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用，本发明通过融合PCR的方式构建启动子Ppr和乳铁蛋白的表达框，并利用P43启动子控制阻遏蛋白CI857的表达。进一步优化Ppr启动子上CI857结合位点的序列的间隔长度，通过发酵实验发现，不同长度的间隔序列导致不同的转录水平。其中三个结合位点之间的间隔序列分别为10bp时，与初始启动子相比，乳铁蛋白的转录水平提高了将近5倍，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.2倍，达到了80mg/L。本发明能够有效的提高乳铁蛋白的表达量，并避免额外诱导剂的添加。

技术领域

本发明涉及一种利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种非血红素铁结合蛋白，是转铁蛋白家族中的一员，乳铁蛋白最显着的理化特性是其对铁的高亲和力，可提高铁在肠道细胞中的生物利用度，稳定还原后的铁离子，减少对肠胃的刺激，还具有抗氧化活性、抗菌、抗病毒活性，并具有抗癌和抗炎特性。乳铁蛋白的抗微生物活性已在体外和体内得到广泛证明体内对抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

在过去的十几年中，研究者以细菌、真菌、植物和动物细胞作为宿主进行乳铁蛋白的异源表达。目前，微生物合成乳铁蛋白最多的宿主是毕赤酵母，毕赤酵母表达系统虽然具有各哺乳类细胞的翻译后加工和修饰功能，是真核基因外源表达的理想宿主，但是甲醇氧化酶启动子Paox1是毕赤酵母中最常用的启动子之一。启动子Paox1需要甲醇作为唯一碳源进行诱导，而甲醇应用在食品工业中具有潜在的危害。哺乳动物细胞作为宿主虽然能够为乳铁蛋白进行糖基化修饰，更能模拟在人体中的状态，但是哺乳动物细胞生长周期很长，培养复杂，难以实现大规模的生产。因此，探寻一种即能高效表达乳铁蛋白，又能对减少在食品领域的隐患。

大肠杆菌表达系统经过不断的改进优化，具有生产周期短、效率高、成本低等一系列的优点，但是也存在系统自身的缺陷性，至今人们利用该系统仍无法解决膜蛋白以及一些毒性蛋白表达，严重制约着大肠杆菌表达系统的应用。利用大肠杆菌表达乳铁蛋白，合成的乳铁蛋白能够明显的抑制大肠杆菌的生长。

发明内容

为了解决需要添加额外的诱导剂使乳铁蛋白表达，并避免诱导剂所带来的潜在危害。本发明以大肠杆菌BL21为出发菌株，利用温敏型启动子Ppr表达乳铁蛋白，实现提高乳铁蛋白的表达量，以及无需添加诱导剂的目的，提供了一种增加蛋白表达水平的方法。

本发明的第一个目的是提供一种利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株，所述的菌株以大肠杆菌为宿主异源表达人乳铁蛋白，其中，所述的人乳铁蛋白通过Ppr启动子启动表达。

进一步地，所述的Ppr启动子包括三个阻遏蛋白CI857的结合位点，所述的阻遏蛋白CI857通过P43启动子控制表达。

进一步地，三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列长度为10bp。

进一步地，所述的人乳铁蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，三个阻遏蛋白CI857的结合位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

进一步地，三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列的氨基酸序列如SEQID NO.9所示。

进一步地，所述的人乳铁蛋白和Ppr启动子整合在质粒peT20b上。

进一步地，所述的宿主为大肠杆菌BL21。

本发明的第二个目的是提供所述的菌株的构建方法，包括如下步骤：

S1、将人乳铁蛋白编码基因和Ppr启动子序列整合至质粒peT20b上；