[发明专利]miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用

说明书

本发明公开了miR‑491、miR‑381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用，包括miRNAs对CART抑制作用的比较分析；检测293T细胞基因表达，包括细胞总RNA提取及检测；mRNA反转录；miRNA反转录；引物设计；荧光定量PCR检测；检测293T细胞CART蛋白表达，包括细胞总蛋白提取；BCA法蛋白浓度测定；上样；电泳；转膜；封闭；一抗、二抗孵育；显影；miR‑491、miR‑381对小鼠CART表达的调控，包括qRT‑PCR检测小鼠下丘脑组织基因表达；Western blot检测小鼠下丘脑组织CART蛋白表达；Elisa检测小鼠血清CART浓度。

技术领域

本发明涉及基因表达调控技术领域，具体为miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用。

背景技术

牛属于单胎动物，在一个发情周期内通常只有一个卵泡发育成熟并释放卵子，其余卵泡均发生闭锁。可卡因-苯丙胺调节转录肽(Cocaine and Amphetamine RegulatedTranscript Peptide,CART)是一种下丘脑分泌的内源性神经肽，通过抑制促卵泡素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)诱导的牛卵巢卵泡颗粒细胞(Granulosa Cells,GCs)增殖和雌激素(Estrogen,E2)分泌进而抑制牛卵泡发育，引起卵泡闭锁，降低排卵率，排卵率低极大制约了养牛产业的持续健康发展。微RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA，研究表明，miRNA可通过与其靶基因的3′UTR区不完全互补配对抑制后续翻译过程，从而影响该蛋白的生物学功能。

发明内容

本发明的目的在于提供miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，发明提供如下技术方案：miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用，其特征在于：具体包括miRNAs对CART抑制作用的比较分析和miR-491、miR-381对小鼠CART表达的调控；

所述miRNAs对CART抑制作用的比较分析，具体包括以下步骤：

步骤一：脂质体转染法转染293T细胞；

步骤二：qRT-PCR检测293T细胞基因表达，具体包括：细胞总RNA提取及检测；mRNA反转录；miRNA反转录；引物设计；荧光定量PCR检测；

步骤三：Western blot检测293T细胞CART蛋白表达，具体包括：细胞总蛋白提取；BCA法蛋白浓度测定；聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)配制；上样；电泳；转膜；封闭；一抗、二抗孵育；显影；

所述miR-491、miR-381对小鼠CART表达的调控，具体包括以下步骤：

步骤一：小鼠侧脑室注射；

步骤二：qRT-PCR检测小鼠下丘脑组织基因表达；

步骤三：Western blot检测小鼠下丘脑组织CART蛋白表达；

步骤四：Elisa检测小鼠血清CART浓度。

优选的，所述脂质体转染法转染293T细胞，具体包括：