[发明专利]一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法

说明书

本发明公开了一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法，包括SMN1‑SNP五个突变位点的引物对，所述五个突变位点的引物对分别为c.863G＞T引物对、c.400G＞A引物对、c.689C＞T引物对、c.683T＞A引物对、c.22dupA引物对。本发明通过设计ARMS‑PCR引物，建立惰性的PCR扩增反应体系，可以有效实现突变体能进行PCR扩增，而野生型不能扩增，然后通过设计不同突变体扩增子Tm值与对应内参基因扩增子Tm值进行差值计算，得到ΔTm值，通过ΔTm值的大小即可实现SMN1基因不同突变位点的检测，通过该方法可以显著缩短因采用巢式PCR后经一代测序检测突变位点的周期和避免繁琐的检测流程。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法。

背景技术

SMA的主要致病基因位于5号染色体5q11.2-13.3区域,该区域整体呈现为一个巨大的反向重复结构，区域内结构复杂,从而导致该区域内容易发生非等位基因间同源重组，造成基因缺失或重复等异常。研究发现，SMN基因存在两个高度同源的基因被命名为运动神经元存活基因(survival motor neuron,SMN)，分别为端粒侧SMN1和着丝粒侧SMN2，而SMN1基因的缺失是导致脊髓性肌萎缩的主要原因，SMN2基因的拷贝数与SMA临床表现严重程度相关。虽然SMN2基因与SMN1基因高度同源，仅存在5个碱基的差异，但SMN1可以表达稳定、完整的功能的SMN蛋白,而SMN2转录的大部分产物由于没有正确剪接，仅有约10％的mRNA拼接正确并翻译出具有正常活性SMN蛋白。研究表明，约95％的SMA患者存由7号外显子SMN1基因纯合缺失导致，另外5％的SMA患者7号外显子SMN1基因杂合缺失但仅存的SMN1拷贝上出现致病性突变或其他未知致病原因，需结合临床症状和Sanger测序等其他技术手段，方可确诊是否患有SMA疾病。由于存在高度同源且基因长度较长的SMN2基因，常规PCR结合Sanger测序难以避免SMN2基因的干扰，给该基因点突变的检测带来诸多困难。

目前临床上针对SMN1基因拷贝数检测主要检测方法：限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应技术(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(PCR-DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR法、数字PCR技术(Digital PCR)等。PCR-RFLP仅可用于SMN1基因7号外显子纯合缺失患者的定性分析(即0拷贝)，不能检测杂合缺失型的携带者(即单拷贝)，而技术本身也存在酶切不完全导致错判的结果。PCR-DHLPC法、MLPA法可用于检测纯合缺失型患者和杂合缺失型的携带者，且MLPA法可以实现对基因0拷贝、单拷贝、两拷贝、三拷贝及四拷贝的定量分析。然而，约有5％左右的SMA患者或携带者是因为存在SMN1基因点突变导致，而仅通过基因拷贝数定量分析无法有效进行相关疾病的确诊，导致出现误诊或漏诊。

专利CN109136366A中通过应用等位基因特性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)、毛细管电泳等技术对目的位点进行扩增，从而对野生型和突变型进行分型。由于野生型和突变型引物比较接近，难以区分；存在不同位点间的片段区分度不大、受毛细电泳管检测区间的长度的限制，且检测突变位点有限的等缺点。

专利CN111607645A利用基因分型芯片检测分析SMN1基因及SMN2基因拷贝数变异水平，并同时分析SMN1基因常见基因突变，实现SMA疾病的遗传诊断。但该技术检测灵敏度较低、操作复杂反应时间较长且成本昂贵不利于大规模推广、结果分析处理对专业性要求较高。

虽然诸如CN 105039318A、CN 103789440A、CN 104480206A等专利还提出了利用荧光PCR等技术检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变的方案，但这些技术方案普遍存在准确性低、可靠性差、成本高而不利于产前诊断和大规模人群筛查等缺陷。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法，以解决现有技术所存在的不足。