[发明专利]PML-RARA融合基因突变的检测方法

说明书

本发明提供一种PML‑RARA融合基因突变的检测方法，本发明中通过下一代测序技术（NGS）方法能够准确地检测出PML和RARA的融合基因发生的变化情况，本发明的方法能够同步检测基因突变、缺失、增加、和颠换等多种基因变异类型，全面指导临床急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）的诊断，指导后续砷剂或全反式维甲酸（ATRA）治疗和耐药选择。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种PML-RARA融合基因突变的检测方法。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）是急性髓细胞白血病（AML）的一种特殊亚型，发病率占急性白血病的6～9%。据统计，国内APL发病率高于西方国家10%左右，占AML的18.7%，部分地区比如东北油田的发病率则高达20%〜30%。约98%的APL伴有经典的t(15;17)(q22;q21)染色体易位，易位使15q22上的PML基因与17q21上的维甲酸受体α基因发生交互性重排，产生PML/RARA融合基因，其蛋白产物导致细胞分化阻滞和凋亡不足，是APL发生的主要分子机制。PML-RARA融合基因依据PML断裂位置不同，有三种亚型，分别为Bcr1、Bcr2和Bcr3，分别称为长型(L型)、变异型(V型)和短型(S型)，发生的概率则依次为55%、5%和40%。另有低于2%的APL 患者表现为其他非经典PML-RARA融合。APL临床发病急，起病及诱导治疗过程中容易发生出血和栓塞，曾是最凶险的急性白血病，然而近年来全反式维甲酸（ATRA）及三氧化二砷的规范化临床应用，能靶向降解PML/RARA融合蛋白，恢复野生型PML和RARA基因功能，可使APL的完全缓解率达90%-95%，并可使APL患者的5年无病生存率达到90%以上。同期研究表明部分复发性或顽固性APL患者，再用砷剂治疗效果较差。这部分人群原发性耐药的主要原因是可能存在特殊变异型APL，即RARA基因与除PML基因以外的其他伙伴基因发生的易位，或者RARB、RARG的罕见融合类型。而部分复发难治的APL患者主要的耐药机制是PML-RARA融合基因出现获得性的突变。有研究发现30%～40%复发患者PML-RARA融合基因RARA部分配体结构域（LBD）存在突变，由于基因突变的LBD构象发生改变，ATRA对其结合力降低，且释放核受体共抑制复合物与招募激活复合物异常，导致对ATRA耐药。而PML-RARA融合基因的PML部分B-box锌指结构域B2区基因突变，能够减弱砷剂对PML-RARA的负调控，导致癌蛋白保留，已被证实的耐药位点有A216V、S214L、L218P、A216T等。因此临床准确的检测PML-RARA融合极其相关耐药突变是鉴别APL、指导后续用药、以及后续微小残留灶（MRD）监测的基础。

现有的主流PML-RARA融合突变检测方法主要集中于以下3个技术：

1.PCR法：PCR检测灵敏度高，但只能用于已知转录本的检测，比如PML/RARA融合基因会出现一些不常见的融合形式。同时PCR方法只能检测很小范围内的基因序列，耐药位点检测不全面。而当基因序列发生变异时，易出现假阴性结果。

2.核型分析：常规核型分析的灵敏度低，有典型的染色体易位可以检测出来，需要对样本进行细胞培养，受制于中期染色体质量；对于不典型易位或隐匿型易位较难检测；无法进行耐药位点检测。

3.荧光原位杂交（FISH）：采用双色探针直接靶定断裂点两端检测PML/RARA融合基因，具有敏感，特异，高效的特点，是临床常用检测手段。但是对于样本要求较高，无法进行血液等液体样本检测。对于不典型易位或隐匿型易位，也可能造成漏检。无法进行耐药位点检测。

4.转录组测序（RNA-seq）：利用高通量测序技术将对肿瘤样本中的全转录组mRNA进行测序。目前主要以二代NGS测序平台为主流。该技术灵敏度较高，可以区分融合产物和融合伴侣，但检测费用较高，并且RNA不稳定容易降解，对样本要求较高，也无法进行耐药位点检测。