[发明专利]合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用

说明书

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，公开了一种合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用。该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；构建方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；发酵合成樱花素的方法包括：将前述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；或者，按照前述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。该重组菌株发酵合成樱花素的产量较高，为樱花素的微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。

技术领域

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，具体地，涉及一种合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用。

背景技术

樱花素(4,5-二羟-7-甲氧黃烷酮)是一种复杂的天然产物，属于类黄酮家族，由一些植物(如灌木和水稻)合成。樱花素已被发现具有多种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗诱变、抗幽门螺杆菌、抗利什曼病和抗锥虫等。由于樱花素具有潜在的营养和医药市场价值，开发高效的生物合成方法具有重要的研究意义，其中，利用微生物作为宿主进行樱花素的生产，可以有效规避天然樱花素生产过程中生长速度慢、产品效价低的问题，因此具有很强的研究和应用价值。

解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是食品安全级菌株，是应用最广泛、研究最多的非常规酵母之一，具有理化特征和遗传背景较清晰、分子操作相对成熟、代谢调控可控等优势，且由于其抗逆性强、耐酸碱环境、底物谱广、胞内乙酰辅酶A和三羧酸循环代谢通量高等特殊的理化性质和代谢特征，被广泛地认为具有卓越的生物技术工业应用价值，因此已被开发作为诸多精细化学品和天然产物的潜在微生物细胞工厂，产品包括二十二碳六烯酸、赤藓糖醇、柠檬酸、2-苯乙醇、番茄红素、虾青素、法尼烯、芳樟醇、花生四烯酸和紫色杆菌素等。

但是，目前解脂耶氏酵母应用于合成樱花素的研究报道较少，且微生物合成樱花素的产量较低，难以满足实际生产的需求。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的微生物合成樱花素的产量较低的问题，提供一种合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法，该重组菌株发酵合成樱花素的产量较高，为樱花素的微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种合成樱花素的重组菌株，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；其中，所述重组菌株中的至少部分预苯酸脱氢酶基因被敲除。

优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述出发菌株为解脂耶氏酵母。

优选地，所述出发菌株为敲除基因Ku70并过表达柚皮素甲基转移酶的解脂耶氏酵母，其中，所述基因Ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述柚皮素甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明第二方面提供一种构建重组菌株的方法，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；其中，所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活的方式为基因敲除。

优选地，所述出发菌株为解脂耶氏酵母。

优选地，所述出发菌株为敲除基因Ku70并过表达柚皮素甲基转移酶的解脂耶氏酵母，其中，所述基因Ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述柚皮素甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。