[发明专利]合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用

权利要求书

1.一种合成樱花素的重组菌株，其特征在于，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；

其中，所述重组菌株中的至少部分预苯酸脱氢酶基因被敲除。

2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株为解脂耶氏酵母；

优选地，所述出发菌株为敲除基因Ku70并过表达柚皮素甲基转移酶的解脂耶氏酵母，其中，所述基因Ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述柚皮素甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.一种构建重组菌株的方法，其特征在于，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；

其中，所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活的方式为基因敲除。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述出发菌株为解脂耶氏酵母；

优选地，所述出发菌株为敲除基因Ku70并过表达柚皮素甲基转移酶的解脂耶氏酵母，其中，所述基因Ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述柚皮素甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

优选地，所述基因敲除的过程包括：先构建重组载体，再经同源重组，用所述重组载体中的尿嘧啶筛选标记URA替代所述出发菌株中的预苯酸脱氢酶基因；

优选地，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述尿嘧啶筛选标记URA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

7.权利要求1至3中任意一项所述的重组菌株或权利要求4至6中任意一项所述的方法在合成樱花素中的应用。

8.一种发酵合成樱花素的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1至3中任意一项所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；

或者，按照权利要求4至6中任意一项所述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件包括：接种量为4-6体积％，温度为25-35℃，转速为150-300rpm，时间为80-160h；

优选地，所述发酵的过程包括：在发酵40-55h时向发酵液中加入L-酪氨酸；

优选地，所述发酵液中L-酪氨酸的添加量为4-6g/L。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤和至少一种氨基酸；

优选地，所述发酵培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸；

优选地，所述发酵培养基含有：葡萄糖30-50g/L，硫酸铵1-1.3g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.5-2g/L，腺嘌呤0.01-0.02g/L，L-精氨酸0.02-0.08g/L，L-天门冬氨酸0.05-1g/L，L-组氨酸0.01-0.03g/L，L-异亮氨酸0.02-0.08g/L，L-亮氨酸0.05-0.15g/L，L-赖氨酸0.02-0.08g/L，L-甲硫氨酸0.01-0.03g/L，L-苯丙氨酸0.02-0.08g/L，L-苏氨酸0.05-0.15g/L，L-色氨酸0.02-0.08g/L，L-酪氨酸0.02-0.08g/L，L-缬氨酸0.05-0.25g/L。