[发明专利]一种定量检测MT-ATP6 m.9185位点异质性的引物组、探针和试剂盒

说明书

本发明公开了一种定量检测MT‑ATP6m.9185位点异质性的引物组、探针和试剂盒，涉及生物技术领域。所述引物组包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述探针包括如SEQ ID NO:3所示的野生型探针和如SEQ ID NO:4所示的突变型探针。所述试剂盒包括上述的引物组和探针。本发明提供了一种定量检测MT‑ATP6m.9185位点异质性的引物组、探针和试剂盒，可以实现对人单细胞样本MT‑ATP6m.9185位点异质性的高准确性、高灵敏性和高重复性检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种定量检测MT-ATP6m.9185位点异质性的引物组、探针和试剂盒。

背景技术

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的MT-ATP6基因编码线粒体能量代谢关键酶F₁F₀ATP合酶复合体的ATP6亚基。MT-ATP6突变一直被认为是线粒体病的致病原因之一。m.9185TC突变首次在一名7岁患者中被发现，该患者出现突发性上睑下垂、眼底麻痹和疲劳。尽管m.9185TC在异质性为85％时，出现的是孤立的轴突神经病，但是更高的突变负荷会导致更严重的神经表型，包括神经源性肌无力、共济失调、色素性视网膜炎，以及早发型和晚发型Leigh综合征(Leigh syndrome,LS)。并且，m.9185TC表现出惊人的疾病表型的组织特异性。LS是最常见的线粒体病，其临床表型包括伴有基底节区和/或脑干功能障碍的神经系统症状。LS通常出现在幼儿期，患者表现为生长发育迟缓、脑病、肌张力障碍、基底节区和脑干的T2对称高信号。此外，还可出现中枢神经系统以外的全身性问题，如肾衰竭、心肌病、糖尿病等，使LS成为一种具有多种临床特征的疾病。

目前线粒体病没有特殊的治疗方法，仅能对症治疗，患者致死致残率高。因此，预防线粒体病孩子的出生就成为阻断线粒体病传递的唯一方法。然而，相对于核基因组导致的遗传病，产前诊断(prenatal diagnosis,PD)和胚胎置入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)在阻断mtDNA突变导致线粒体病的传递的临床应用上面临挑战。由于mtDNA遵循母系遗传，后代中突变mtDNA的比例与母亲相关。然而，由于mtDNA在卵母细胞发育过程中的遗传瓶颈效应，导致卵母细胞中可能出现完全不同于母体的异质性变化，瓶颈效应会导致后代异质性具有一定的不可预测性。并且，由于m.9185相关突变的异质性程度与疾病严重程度明显相关，因此在产前诊断和胚胎植入前遗传学过程中，对脐血、羊水，以及胚胎活检的单细胞样本的m.9185突变异质性的准确定量至关重要。

目前，有多种方法可以检测mtDNA异质性，包括二代测序法(Next-generation sequencing,NGS)、Sanger测序法、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)、SNaPshot、焦磷酸测序、荧光定量PCR法等。HPLC虽然可以检测mtDNA突变位点基因型，但是无法定量突变负荷。Sanger测序法和SNaPshot对异质性5％的样本敏感性低。荧光定量PCR依赖于标准溶解曲线，因而只能实现相对定量，且PCR影响因素多，易受样本中各种金属离子等PCR抑制物的影响。焦磷酸测序和NGS，尤其是NGS，被广泛应用于mtDNA异质性水平的定量，特别是对异质性非常低的样品，结果准确、灵敏，但是二者成本过高，难以在大规模临床样本中推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测MT-ATP6m.9185位点异质性的引物组、探针和试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，实现对人单细胞样本MT-ATP6m.9185位点异质性的高准确性、高灵敏性和高重复性检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：