[发明专利]外泌体miRNA-485-3p和miRNA-885-5p作为肝癌诊断标志物的应用

权利要求书

1.用于诊断早期肝癌的外泌体为miRNA-485-3p和/或miRNA-885-5p。

2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，

miRNA-485-3p的序列为5’-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3’；

miRNA-885-5p的序列为5’-UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3’。

3.权利要求1所述的外泌体miRNA-485-3p和/或miRNA-885-5p在诊断肝癌方面的应用。

4.权利要求1所述的外泌体miRNA-485-3p和/或miRNA-885-5p在诊断早期肝癌方面的应用。

5.权利要求1所述的外泌体miRNA-485-3p和/或miRNA-885-5p作为肿瘤标记物在诊断早期肝癌方面的应用。

6.权利要求1所述的外泌体miRNA-485-3p和/或miRNA-885-5p在制备早期肝癌诊断标记物的产品中的应用。

7.权利要求1所述的外泌体miRNA-485-3p和/或miRNA-885-5p在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。

8.根据权利要求权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肝癌为早期肝癌。

9.权利要求1所述的外泌体的制备方法，主要包括以下3个部分：

1)分离血浆中的外泌体；

2)提取外泌体中miRNA；

3)荧光定量PCR反应检测miRNA。

10.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)血浆样品的制备

在采血管中加入EDTA抗凝剂，采集完血液后，将采血管缓慢颠倒混匀，混匀的全血4℃1,000-2,000×g离心5-10min，上层黄色半透明液体即为待收集的血浆，吸出血浆时贴着页面逐渐往下吸，切勿吸出细胞成分；收集到的血浆可直接用于后续实验或分装好-80℃冰箱保存，

2)外泌体的提取

将血浆室温，2,000×g离心20min，去除残留细胞及碎片；转移上清到新的离心管中，注意不要吸到底部沉淀；室温，10,000×g离心20min，去除残留碎片；用移液器转移上清到新的离心管中，1ml血浆样品，加入500ul 1×PBS及300ulVEX Exosome Isolation Reagent溶液，混匀后将混合液竖直放于2-8℃静置30min进行孵育，室温10,000×g离心5min去上清，然后室温10,000×g离心30s，用移液器吸除残留液体，血浆外泌体即存在于管底部沉淀中，

3)外泌体miRNA的提取

外泌体miRNA提取使用试剂盒，主要操作步骤如下：①取外泌体，加入1ml Trizol充分匀浆，振荡器振荡或移液器吸打数次混匀，室温静置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离，②4℃12,000rpm(13,400×g)离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中，③加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min，④4℃12,000rpm(13,400×g)离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液MZ试剂的50％，把水相转移到新管中，进行下一步操作，⑤量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入向吸附柱miRspin中，室温12,000rpm(13,400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入向吸附柱miRspin中，请分两次转入，离心后弃掉向吸附柱miRspin，保留流出液，⑥量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute中，室温12,000rpm(13,400×g)离心30sec，⑦向吸附柱miRelute中加入500μl去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃废液，⑧向吸附柱miRelute中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，室温12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃废液，⑨重复操作步骤7，⑩将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12,000rpm(13,400×g)离心1min，去除残余液体，将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5ml离心管中，加15μl RNase-FreeddH2O，室温放置2min，室温12,000rpm(13,400×g)离心2min，

4)cDNA合成

取20ngRNA，基于ReverTra Ace qPCR RT Kit：FSQ-101,TOYOBO逆转录试剂盒进行，加入2ul 5×RT Buffer，0.5ul Primer Mix，0.5ul RT Enzyme Mix，加无酶水至10ul总体系，37℃条件下，进行15min的逆转录反应→在98℃条件下，进行5min的酶失活反应→反应结束后，取部分进行10×浓度稀释，每一个miRNA都要一条特异的反转录引物，所以每一个miRNA的反转录反应都是独立进行的，

5)cDNA产物进行荧光定量PCR反应

按照RR820A takaraPremix Ex Taq^TMII相应不走进行，所有反应均做3个复孔，10ulPremix，上下游引物各0.5ul，1ul模板样品，灭菌水8ul，共计20ul反应体系，PCR反应条件为50℃，2min，95℃，10min；95℃，1min；95℃，15s，60℃，30s，40个循环，终点采集荧光，通过该反应可以得到各个miRNA在不同样本中的表达量，进而进行后续分析，

6)数据分析

荧光定量PCR检测miRNA相对表达量，最终结果以2^-△△Ct分析，采用专业作图软件Graphpad Prism7进行作图并统计分析，P＜0.05时，有显著性差异，分析内容为miRNA在早期肝癌患者、慢性HBV患者和健康人群中表达的个体差异分析。