[发明专利]一种利用生物膜干涉技术快速检测金黄色葡萄球菌的方法

说明书

本发明公开了一种利用生物膜干涉技术快速检测金黄色葡萄球菌的方法，该方法为：步骤一、传感器平衡；步骤二、传感器活化；步骤三、抗体固定化；步骤四、一次封闭；步骤五、二次封闭；步骤六、样品检测及结果分析。本发明的有益效果：步骤少，无标记，实时监测，简便快捷，结果判断简单；操作简单易学，仅需要向样品板中添加配置好的试剂及制备好的样品即可上机检测，实时读取结合信号即可判断金黄色葡萄球菌的存在；醋酸‑醋酸钠缓冲溶液稀释后的抗体可回收后重复使用，降低检测成本；检测高通量，配合相应的生物分子相互作用仪及配套使用的样品板，可实现多达95个样品的同时检测；具有较好的特异性，可排除样品中非目标菌的干扰。

技术领域

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌的快速检测方法，特别涉及一种抗体结合生物膜干涉技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是广泛存在于自然界和人体皮肤上的兼性厌氧革兰氏阳性菌，是皮肤化脓感染常见的病原菌，其产生的肠毒素会导致中毒。食品易受其污染，导致人体食物中毒，主要症状是发烧、腹泻和恶心呕吐。金黄色葡萄球菌分泌20多种毒性蛋白质，常见的有7种，可耐高温，100℃加热30min不被破坏。据报道成人仅食用约100ng肠毒素A，即可导致食物中毒。近几年，我国因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居全世界第4位。目前，传统的金黄色葡萄球菌检测方法具有灵敏度高、成本低的优点，但选择性前增菌、选择性平板培养、染色镜检和血浆凝固酶鉴定等步骤复杂，耗时长，不能满足快速检测的需要。免疫学检测方法(如酶联免疫技术)检测时间明显缩短，但对试剂的选择性高。因此，为减少相关食源性疾病的发生，快速便捷、灵敏准确且易于操作的金黄色葡萄球菌的新型检测方法亟需开发。

生物膜干涉(biolayer interferometry，BLI)技术是通过实时监测光干涉信号的变化来实现生物分子的相互作用分析或检测。该技术所使用的Octet是多通道检测设备，整个检测过程完全自动化，能够控制检测模块的温度，并且检测后样品可回收。该技术具有高灵敏度、无微流控系统、免标记、快速、简便、可实时提供检测结果等优点，非常适合于对食源性致病菌进行快速、灵敏的检测。

抗体是生物传感器中应用范围最广的识别元件，根据其制备方法和原理，可分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。使用抗体进行抗原识别被称为免疫测定法，它被用于各种生物传感器形式。但以抗体作为BLI生物传感器的生物识别元件并将该技术应用于食源性致病菌的快速检测却鲜有报道。

本发明以抗体作为第二代氨基偶联传感器的生物识别元件对金黄色葡萄球菌进行识别检测。第二代氨基偶联传感器增加了结合密度，固化条件也更为稳定，同时大幅降低了非特异性结合。传感器表面适用于各种pH和盐条件，为更高通量应用的再生条件开发提供了坚固性和灵活性。第二代氨基偶联传感器表面修饰有羧基基团，抗体固定时，传感器表面的羧基基团先在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合的活化试剂中活化后形成NHS酯；NHS酯可与抗体上的氨基基团反应形成极其稳定的酰胺键从而把抗体固定在第二代氨基偶联传感器表面。若样品中存在金黄色葡萄球菌，则菌体会被固定在表面的抗体特异性识别并结合，使传感器光学层厚度增加，干涉光谱产生位移，产生的响应信号被光谱仪实时检测记录从而实现金黄色葡萄球菌的实时无标记快速检测。

发明内容

本发明的目的是为解决传统检测金黄色葡萄球菌方法中步骤多、操作繁琐等问题而提供的一种基于生物膜干涉技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法。

本发明提出了一种抗体结合生物膜干涉技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法。该方法包括传感器平衡、传感器活化、抗体固定化、一次封闭、二次封闭、样品检测及结果分析，其具体步骤如下：

步骤一、传感器平衡：先将第二代氨基偶联传感器末端浸入纯水中预湿至少10分钟，以平衡传感器；

步骤二、传感器活化：将平衡后的第二代氨基偶联传感器浸入20mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和10mM N-羟基琥珀酰亚胺混合试剂中活化300-450秒；