[发明专利]一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术构建尿嘧啶生物合成相关基因被破坏的突变拟轮枝镰孢菌，为拟轮枝镰孢菌中尿嘧啶生物合成相关基因功能的研究奠定了分子生物学基础。本发明利用CRISPR/Cas9技术破坏拟轮枝镰孢菌中的尿嘧啶生物合成相关基因，建立了一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9基因编辑体系，从而促进拟轮枝镰孢菌的基因功能研究，为发掘更多具有生物学功能的基因奠定分子生物学基础。

技术领域

本发明涉及一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

背景技术

拟轮枝镰孢菌是一类全球范围发生的植物病原真菌，不仅能够通过病原菌侵染造成玉米减产，而且能够产生多种真菌毒素，污染农作物以及农副产品，对人畜的健康造成影响。因此对其功能基因组进行研究以寻找药物靶标来开发相关农药具有重要的经济意义。目前拟轮枝镰孢菌的功能基因组研究受到研究方法效率低以及抗性筛选标记数量少的限制，进展相对缓慢，因此发展新的基因编辑技术对拟轮枝镰孢菌的基础研究、代谢工程以及合成生物学研究等具有重要意义。

尿嘧啶生物合成相关基因可作为营养缺陷型筛选标记应用于丝状真菌的基因功能研究。pyrG基因编码的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶和pyrE基因编码的乳清酸磷酸核糖转移酶在尿嘧啶的从头合成途径中起着重要作用，任何一个基因缺失所产生的尿嘧啶缺陷型菌株都不能正常合成生长所必须的尿嘧啶，必须在外源补充尿嘧啶的情况下才能够生长，同时该突变体还可以被5-氟乳清酸(5-FOA)反向筛选。5-FOA筛选的机制如下：5-FOA可以作为乳清酸类似物进入尿嘧啶从头合成路径，最终产生具有细胞毒性的5-氟尿嘧啶，因此野生型菌株的生长会受到抑制，而营养缺陷型菌株因缺少尿嘧啶合成途径，无法将5-FOA转化为有毒物质，因此可以生长。这些特性使得pyrG和pyrE基因具有开发成为抗性筛选标记基因的潜力。对拟轮枝镰孢菌中的尿嘧啶生物合成相关基因进行研究能够促进该类病菌中传转化筛选标记的发掘。

CRISPR/Cas9是近年来快速发展的一种基因编辑技术，主要包含两部分：具有DNA双链剪切功能的Cas9蛋白和能够识别靶标位点的sgRNA。其中sgRNA由能够与靶标DNA序列结合的crRNA以及能够与Cas9蛋白结合的tracRNA组成，crRNA通过tracRNA将Cas9蛋白引导至靶标基因处对DNA双链进行切割，结合生物体自身的DNA修复机制，人为设计实验，即可实现对基因的破坏、敲除、敲入以及单碱基编辑等目的。由于CRISPR/Cas9系统具有原理简单、操作简便、敲除效率高以及成本低廉等优点，已经在动物、植物、细菌以及真菌等生物体中得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，解决了目前拟轮枝镰孢菌基因组功能研究方法效率低以及抗性筛选标记数量少的问题，加快了研究进展，对拟轮枝镰孢菌的基础研究、代谢工程以及合成生物学研究等具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明提供的一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，具有如下技术方案：

一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

S1.根据尿嘧啶生物合成相关基因pyrG和pyrE的外显子序列，分别选取核酸序列为如SEQ IDNO.1和SEQ IDNO.2所示的靶标位点locus505和locus86；