[发明专利]慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用

说明书

本发明公开了慢病毒载体在制备治疗β‑地中海贫血药物中的应用，所述慢病毒载体由pCCL‑SIN‑cPPT‑MCS‑RbPA骨架、A调控序列、B启动子序列、C增强子序列和D基因序列构成。本发明慢病毒可增强基因的特异性表达，降低载体大小从而提高病毒包装效率，降低病毒载体对受试细胞潜在致癌风险，将慢病毒载体感染β‑地中海贫血患者造血干细胞（CD34+细胞），用高效液相色谱定量含有第87位氨基酸突变的外源β珠蛋白（Hbβ^A‑T87Q）表达水平，可与内源基因表达的或输血来源的野生型β‑珠蛋白区分开，观察到Hbβ^A‑T87Q高表达。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用。

背景技术

β-地中海贫血是世界上最常见的单基因常染色体隐性遗传性疾病之一，其主要是由于β珠蛋白基因或其调控序列缺陷导致β-珠蛋白链合成减少或障碍，进而致使α/β-珠蛋白比例失调无法产生足够的血红蛋白所引起。β-地中海贫血的临床表现与α/β-珠蛋白链失衡的程度密切相关。大多数β⁰/β⁰基因型患者和部分β^E/β⁰基因型患者几乎不产生β链，常常表现为输血依赖型β-地中海贫血，临床症状尤为严重，每年需要100 mL/kg的浓缩RBC(红细胞)或进行≥8次输血。中、重度β-地中海贫血在婴幼儿期就表现为严重的低红色素小细胞性贫血，总Hb（血红蛋白）≤7g/dL。

规范性长期输血和去铁治疗是目前临床缓解中、重度地中海贫血症状的常规方案。但是年均治疗费用10万元以上，而且长期大量输血会加重患者铁离子沉积，最终因铁超载导致器官衰竭而死亡。HLA 相合的骨髓移植、脐带血移植是目前临床能根治输血依赖β地贫的唯一方法，年均医疗费用40万元左右。由于合适供者来源受限及费用昂贵，大部分患者难以得到及时的救治。并且异体骨髓移植存在一些重大风险，如移植过程中的感染、移植失败和移植物抗宿主病（GvHD）等，其中一些甚至是致命的。因此，基于基因治疗的自体CD34+细胞移植目前正成为“一站式”治愈β-地中海贫血的新希望，其最大的优势在于不需要骨髓捐赠和异体移植，而且一次治疗可永久性“治愈”，可取代异体骨髓移植的治疗方案。

针对β-地中海贫血的基因治疗策略大致分作两个方面：基因替代和基因矫正。前者通过整合或染色体外分子的形式用正常基因替代内源功能缺陷基因；后者通过基因打靶或基因编辑手段完全修复突变基因为野生型。β-地中海贫血基因治疗多采用慢病毒载体介导的CD34+细胞的β-珠蛋白基因替代策略，2019年在欧洲获批上市的蓝鸟生物基因治疗药物LentiGlobin便是基于该策略，通过对患者自体CD34+细胞补充正常β-珠蛋白，避免了因异体骨髓移植引起移植物抗宿主病和后续免疫抑制导致严重机会性感染的风险，同时达到使患者脱离输血依赖的治疗效果。但是，LentiGlobin病毒载体采用β-珠蛋白全基因序列反向插入的常规构建策略，载体结构臃肿庞大（10kb），存在产毒滴度低、生产成本高等一系列限制规模化生产的问题，以及潜在的致肿瘤风险，同时β-珠蛋白体内表达水平中等，仅适用于部分β-地中海贫血和镰状细胞贫血患者，无法满足国内及国际市场需求。

发明内容

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用，能有效解决上述LentiGlobin病毒载体结构臃肿庞大、产毒滴度低、生产成本高、β-珠蛋白表达水平欠佳等不足之处。