[发明专利]一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法

说明书

本发明公开了一种高产L‑色氨酸且低产L‑丙氨酸的大肠杆菌构建方法，根据大肠杆菌E.coli K‑12丙氨酸转氨酶基因中alaA和alaC的序列信息，分别设计带有同源臂的敲除引物对，通过敲除氨基转移酶基因alaA和alaC，有助于重组大肠杆菌更充分地利用碳代谢流用于L‑色氨酸的合成，提升L‑色氨酸的产量，减少大肠杆菌代谢途径中L‑丙氨酸副产物的产量，减轻产品纯化压力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法。

背景技术

作为人和动物所必须的20种氨基酸之一，L-色氨酸(L-Tryptophan,L-Trp)在人和动物体内无法合成，只能从植物和微生物中获取。L-色氨酸被广泛应用于医药、食品和饲料等行业。

L-色氨酸的生产方法有蛋白质水解法、化学合成法、微生物转化法以及微生物发酵法。目前国内外主要利用微生物发酵的方法用以生产L-色氨酸，其中主要平台的微生物有大肠杆菌以及谷氨酸棒杆菌等菌株；在菌株的选育过程中通常通过物理诱变或化学诱变并结合代谢工程理论和基因工程等方法，来选育能够高产L-色氨酸的工程菌株。大肠杆菌作为L-色氨酸发酵的重要平台微生物之一，在L-色氨酸发酵工程工业中起着举足轻重的作用。

大肠杆菌生产L-色氨酸的过程中往往会伴随着副产物的生成，副产物的积累不仅会造成碳源的浪费还可能会对目标产物纯化及回收带来难题，甚至还会对菌体的生长代谢产生潜在危害。减少副产物的产生不仅能够减少副产物对菌体的潜在的危害还能够明显增加目标产物的产量。

在大肠杆菌复杂的代谢途径中氨基酸稳态维持并调节着其细胞本身氨基酸库的平衡，L-丙氨酸通过可逆的转氨基反应途径，如发酵(通过丙酮酸)或氮代谢(通过天冬氨酸和谷氨酸)等连接着这条关键的代谢网络。在大肠杆菌体内丙酮酸既是L-丙氨酸合成的前体物质又是3-脱氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸的合成过程中的直接供体。在菌株发酵过程中，若在丙氨酸大量合成的情况下，丙酮酸的消耗将随之增加，从而使得3-脱氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸的合成也将随之减少，L-色氨酸的合成势必也将受到一定影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法，包括如下步骤：

(1)根据GenBank中已公布的大肠杆菌E.coli K-12丙氨酸转氨酶基因中alaA(Gene ID:946772)和alaC(Gene ID:946850)的序列信息，分别设计带有同源臂的敲除引物对alaA-F1/alaA-R1、alaC-F1/alaC-R1，以质粒pKD13为模板、丙氨酸转氨酶各基因的敲除引物对为引物进行PCR扩增反应，分别扩增出含有卡那霉素抗性基因且与alaA或alaC基因同源的基因片段，PCR反应结束后，于反应产物中按比例加入Dpn I酶，37℃处理1h后于80℃水浴中放置10min终止反应，试剂盒回收产物片段并送去测序；

所述alaA-F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述alaA-R1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述alaC-F1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述alaC-R1的序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)含pKD46电转化感受态的制备及同源基因片段的电转化