[发明专利]一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法

权利要求书

1.一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)根据GenBank中已公布的大肠杆菌E.coli K-12丙氨酸转氨酶基因中alaA(GeneID:946772)和alaC(Gene ID:946850)的序列信息，分别设计带有同源臂的敲除引物对alaA-F1/alaA-R1、alaC-F1/alaC-R1，以质粒pKD13为模板、丙氨酸转氨酶各基因的敲除引物对为引物进行PCR扩增反应，分别扩增出含有卡那霉素抗性基因且与alaA或alaC基因同源的基因片段，PCR反应结束后，于反应产物中按比例加入Dpn I酶，37℃处理1h后于80℃水浴中放置10min终止反应，试剂盒回收产物片段并送去测序；

所述alaA-F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述alaA-R1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述alaC-F1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述alaC-R1的序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)含pKD46电转化感受态的制备及同源基因片段的电转化

挑取含有pKD46质粒的菌株接种于含氨苄青霉素的LB液体摇瓶培养基中，30℃培养过夜，取500μL过夜培养的菌液接种于LB液体摇瓶培养基内，30℃条件下振荡培养至细胞OD₆₀₀＝0.1-0.2，加入一定量过滤除菌的L-阿拉伯糖诱导剂，继续培养至细胞OD₆₀₀＝0.7-0.8时停止培养，迅速放至冰上预冷30-35min，离心并用灭过菌的10％的甘油洗涤两次，取100-200μL洗涤后的细胞，和步骤(1)中含有卡那霉素抗性基因且与alaA或alaC基因同源的基因片段混合后加至电转杯内，进行电击，电击结束后迅速加入SOC复苏培养基，混匀后接种至无菌的离心管中，37℃，100-120r/min振荡培养1.5-2.0h，无菌条件下，将复苏后的菌液涂布于含卡那霉素抗性的LB固体平板上，待菌落长至一定大小后筛选阳性转化子；

(3)阳性转化子的筛选

采用验证引物，通过菌落PCR进行验证，验证阳性转化子是否成功发生同源重组；

(4)卡那霉素抗性基因和质粒pCP20的消除

挑取目的基因成功被卡那霉素基因取代的单菌落接种至含氨苄青霉素的LB液体摇瓶培养基中，37℃条件下过夜培养，制备电转感受态细胞，依然通过电转化的方法将质粒pCP20电转入感受态细胞，加入SOC复苏培养基复苏1.5-2.0h后涂布于含氨苄青霉素的LB固体平板上，30℃培养菌落至合适大小，挑取平板上的单菌落接种于不含任何抗性的LB液体培养基上，30℃培养3h迅速升温至42℃过夜培养，挑取少许菌液划线于不含抗性的LB固体平板上，37℃静置培养，待菌落长至一定大小后再次分别使用验证引物alaC-F1-F/alaC-R1-R进行菌落PCR，筛选目的基因已被敲除的阳性转化子。

2.根据权利要求1所述的一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法，其特征在于：步骤(2)中，LB液体摇瓶培养基内的氨苄青霉素终浓度为100μg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法，其特征在于：步骤(2)中，离心转速为6000-6500r/min，电击电压为2500-2600V。

4.根据权利要求1所述的一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法，其特征在于：步骤(3)中，以alaA-F1-F/check-R和alaC-F1-F/check-R为验证引物，所述alaA-F1-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述alaC-F1-F的序列如SEQ ID NO.7所示，所述check-R的序列如SEQ ID NO.9所示。

5.根据权利要求1所述的一种高产L-色氨酸且低产L-丙氨酸的大肠杆菌构建方法，其特征在于：步骤(4)中，以alaA-F1-F/alaA-R1-R、alaC-F1-F/alaC-R1-R为验证引物，所述alaA-F1-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述alaA-R1-R的序列如SEQ ID NO.6所示，所述alaC-F1-F的序列如SEQ ID NO.7所示，所述alaC-R1-R的序列如SEQ ID NO.8所示。