[发明专利]冠状病毒M蛋白胞外域多肽及其应用

说明书

本发明提供了冠状病毒M蛋白胞外域多肽及其应用，三种冠状病毒的五条膜(membrane，M)蛋白胞外域多肽的氨基酸序列以及作为疫苗抗原和检测抗原的应用，所述多肽可作为Elisa检测试剂，用于检测COVID‑19康复者血清样品和接种两针SARS‑CoV‑2灭活疫苗者血清样品，本发明提供的冠状病毒M蛋白胞外域多肽可应用的方向：①SARS‑CoV‑2感染的临床检测与诊断；②广谱抗SARS‑CoV‑2M蛋白多肽疫苗的设计与研发；③靶向冠状病毒M蛋白抗病毒机制的研究及抗病毒药物的研发。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及冠状病毒M蛋白胞外域多肽及其应用。

背景技术

人类冠状病毒(HCoVs)，例如HCoV-229E和HCoV-OC43，长期以来一直在人群中传播，它们通常引起轻度呼吸道感染，并伴有普通感冒症状。但在最近20年间，人群中出现的SARS-CoV、MERS-CoV以及SARS-CoV-2却具备高传染性和高致病性。相关数据统计，SARS-CoV的全球致死率达到10％，MERS-CoV的全球致死率达到35％，而SARS-CoV-2仍在全球范围内大规模传播，已导致数百万人死亡。新冠病毒的爆发对人类健康和世界经济的发展造成了持续威胁，未来的疫情发展方向仍不明朗。

冠状病毒是一个高度多样化的包膜病毒家族，它包含非分段的正义单链RNA基因组，主要宿主为脊椎动物。冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，有α、β、γ、δ四个亚属，其中SRAS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2被归类为β亚属，SARS-CoV-2与SARS-CoV具有约79％的核苷酸序列同源性，与MERS-CoV具有约50％的同源性。冠状病毒主要由四种结构蛋白组成：S蛋白、M蛋白、包膜蛋白(Envelope，E)、核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白，少数病毒还包含血凝素酯酶(Hemagglutinin-esterase，HE)

S蛋白在病毒附着、进入和诱导中和抗体中起着关键作用，并具有较强的免疫原性，这让其广泛用作疫苗开发的靶点。然而S蛋白是一种高度糖基化的同源三聚体蛋白，冠状病毒可以通过糖基化屏蔽其多肽表位，逃避免疫系统监视。此外，冠状病毒在传播过程中极易突变导致S抗原表位发生漂变，有利于增强病毒的传染性、致病性和免疫逃逸。在最新的一项研究中显示，接种过两针辉瑞BNT162b2疫苗的志愿者血清中和Omicron突变株的效力已经下降到了D614G野生株的1/41。多项临床研究也显示，接种疫苗者的血浆针对α-突变株、β-突变株、γ-突变株以及δ-突变株的中和滴度也有不同程度的下降。因此针对冠状病毒更加保守的结构蛋白设计广谱免疫原将有潜力增强现有疫苗保护效果。

N蛋白位于病毒包膜内难以被抗体触及，但由于其氨基酸序列高度保守的特点，N蛋白常用来研究T细胞免疫应答。E蛋白具有较小的结构，目前基于E蛋白免疫学功能的研究较少。M蛋白是一种在冠状病毒脂质膜上分布拷贝数最多的结构蛋白，它可改变自身构型以调整膜的曲率，促进病毒包膜的形成，并与其他三种结构蛋白相互作用进行病毒颗粒的组装。新冠病毒与SARS-CoV的M蛋白氨基酸序列具有高度的同源性。我们使用开源预测平台AlphaFold Deepmind预测和分析冠状病毒M蛋白结构，结果表明冠状病毒M蛋白结构与葡萄糖转运蛋白SemiSWEET的结构相似，具有三个跨膜螺旋结构域，并包含两个胞外域(预测1-20aa左右的N端胞外域，第二次和第三次跨膜区之间暴露的4个氨基酸残基)及两个胞内域。虽然有学者借助生物信息学工具预测到了SARS-CoV-2 M蛋白N端胞外域含有B细胞表位，但没有相关实验数据支撑其预测表位的准确性。有学者曾在2005年鉴定出SARS-CoV病毒M蛋白N端胞外域包含人B细胞表位，并且由N端1-31aa构成的多肽半抗原能够在小鼠和家兔模型中诱导高滴度的血清抗体，但未验证这些血清抗体是否有抗病毒作用。近期几个研究小组在新冠感染患者的血清中检测到了针对新冠M蛋白N端胞外域的特异性抗体反应，表明M蛋白胞外域包含人B细胞表位，但缺少对其免疫原性的研究。