[发明专利]一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法

说明书

本发明涉及基因测序的技术领域，特别是一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法，包括如下步骤：(1)根据样本DNA选择特异性引物序列，之后在特异性引物序列的5’端加上通用引物序列得到加尾引物序列，根据加尾引物序列合成加尾引物；(2)使用加尾引物配制PCR扩增反应液，加入样本DNA，执行PCR扩增程序，得到PCR扩增产物；(3)PCR扩增产物进行纯化；(4)选择通用引物作为测序引物,对纯化的PCR扩增产物进行循环测序反应；(5)循环测序反应产物经过纯化、变性、上机测序得到样本DNA的序列，本发明通过通用序列和特异性序列引物的结合不仅可以节省Sanger测序的工作量，也可以降低引物加错的可能性。

技术领域

本发明涉及基因测序的技术领域，特别是一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法。

背景技术

Sanger测序法，又称双脱氧链终止反应，与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术，为人类基因组计划所使用的主要测序方法。其原理是测序反应的核心就是利用ddNTP(由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力)，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。

Sanger测序优势是(1)使用的测序技术准确度高于二三代测序。基因突变可分为碱基置换、颠换、缺失和插入4种，sanger测序法对于任何一种突变都可以准确检测；(2)每个反应可以得到700-1000bp的长序列，序列长度高于二代测序。因此，Sanger测序作为基因检测的金标准，广泛应用于的靶基因测序，二代测序和荧光PCR等检测方法的验证。而Sanger测序的主要劣势是一个反应只能得到一条序列，测序通量低。工作流程从样本制备到最终数据分析，包括PCR扩增、PCR产物纯化、循环测序反应、测序反应纯化、毛细管电泳和数据分析。其中循环测序反应需要根据不同PCR扩增产物添加低浓度的单向扩增引物，不仅增加了Sanger测序的工作量，也增加了引物加错的可能性。

发明内容

为此，需要提供一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法，解决现有Sanger测序的工作量大，引物可能加错的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法，包括如下步骤：

(1)根据样本DNA选择特异性引物序列，之后在特异性引物序列的5’端加上通用引物序列得到加尾引物序列，最后根据加尾引物序列合成加尾引物；

(2)使用加尾引物配制PCR扩增反应液，之后加入样本DNA得到PCR扩增反应体系，之后执行PCR扩增程序，得到PCR扩增产物；

(3)使用虾碱酶与外切酶配置成消化液，PCR扩增产物离心后，将消化液加入PCR反应液中进行，反应得到纯化的PCR扩增产物；

(4)选择正向或反向通用引物作为测序引物,对纯化的PCR扩增产物进行循环测序反应；

(5)循环测序反应产物经过纯化、变性、上机测序得到样本DNA的序列。

上述技术方案具有以下有益效果：