[发明专利]一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法

权利要求书

1.一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据样本DNA选择特异性引物序列，之后在特异性引物序列的5’端加上通用引物序列得到加尾引物序列，最后根据加尾引物序列合成加尾引物；

(2)使用加尾引物配制PCR扩增反应液，之后加入样本DNA得到PCR扩增反应体系，之后执行PCR扩增程序，得到PCR扩增产物；

(3)使用虾碱酶与外切酶配置成消化液，PCR扩增产物离心后，将消化液加入PCR反应液中进行，反应得到纯化的PCR扩增产物；

(4)选择正向或反向通用引物作为测序引物,对纯化的PCR扩增产物进行循环测序反应；

(5)循环测序反应产物经过纯化、变性、上机测序得到样本DNA的序列。

2.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，通用引物为是任意常见的通用引物或Tm值50-65℃的序列。

3.如权利要求2所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，通用引物的选择中，以序列M13F：GTAAAACGACGGCCAGT为正向通用引物，序列T7：TAATACGACTCACTATAGGG为反向通用引物。

4.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，特异性引物为PDGFRAe12-F2、PDGFRAe12-R1、PDGFRAe18-F1、PDGFRAe18-R1、KITe9-F1、KITe9-R1、KITe11-F2、KITe11-R2、KITe13-F1、KITe13-R1、KITe17-F1、KITe17-R2、UP-F-M13F、UP-R-T7、MHL1-BSP1-F2或MHL1-BSP1-R3。

5.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，每20μL的PCR扩增反应液包括：10.4μL纯化水，5μL、pH7.5的5X PCR缓冲液、4μL、25mM的MgCl₂、0.2μL、25mM的dNTP、0.1μL、10μM的上游加尾引物、0.1μL、10μM的下游加尾引物和0.2μL Taq酶；

每25μL的PCR扩增反应体系包括20μL的PCR扩增反应液和5μL的样本DNA。

6.如权利要求5所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，步骤(2)中加入样本DNA的浓度为5ng/μl。

7.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，所述PCR扩增程序如下：95℃预变性2min；循环：95℃保持10s，60℃保持30s，72℃保持30s，反应40个循环；4℃保存。

8.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，循环测序反应体系，以10μL计包括：2μL BigDye Reaction Mix，1μL BigDye Sequencing Buffer，3.2μM、0.5μL测序引物，4.5μL无核酸酶水，2μl纯化PCR扩增产物。

9.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，循环测序反应过程如下：95℃预变性2min；循环：95℃保持10s，50℃保持5s，72℃保持90s，反应25个循环；4℃保存。

10.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法，其特征在于，所述样本DNA为但不限于石蜡包埋DNA、新鲜组织DNA或重亚硫酸盐转化DNA样本。