[发明专利]重组大肠杆菌KLUGIN73及其应用

说明书

本发明公开了一种重组大肠杆菌KLUGIN73及其应用，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022248；本发明的大肠杆菌KLUGIN73所产生的嗜热糖苷酶兼有水解葡萄糖苷和鼠李糖苷的能力，底物谱广，能实现淫羊藿苷的二糖基一次性水解，反应条件简单且单一，大幅降低酶法水解淫羊藿苷的成本；本发明涉及的水解淫羊藿苷工艺，目标产物单一，即淫羊藿素，没有副产物产生，产品的得率接近100％；本发明的重组糖苷酶可在纯水相中完全水解10mM的淫羊藿苷，其浓度远超其在水中溶解度的1000倍以上，使得酶法水解淫羊藿苷生产淫羊藿素工艺更具有工业化应用价值。

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种重组大肠杆菌KLUGIN73 及其应用。

背景技术

2022年1月10日，国家药品监督管理局批准淫羊藿素(阿可拉定)软胶囊为国家一类创新药，获批用于不适合或患者拒绝接受标准治疗，且既往未接受过全身系统性治疗的、不可切除的肝细胞癌。其核心成分淫羊藿素 (Icaritin，别名:3,5,7-三羟基-2-(4-甲氧苯基)-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基) -4H-1-苯并吡喃-4-酮，CAS号：118525-40-9)来源于传统草本中药—淫羊藿。

然而草本植物淫羊藿中，淫羊藿素几乎不存在，它通常以结合一分子葡萄糖和一分子鼠李糖的二糖苷形式存在。该糖苷被称为淫羊藿苷 (Icariin，别名:4′-O-甲基-8-γ，γ-dimethylallylkaempferol-3-鼠李糖苷素-7- 葡糖苷，CAS号489-32-7)，属于8-异戊烯基黄酮苷类化合物，在淫羊藿草本中含量低于0.1％。因此必须将淫羊藿苷上两分子糖基水解后才能发挥药效。但是哺乳动物细胞自身无法生产糖苷酶，只能依靠肠道中某些微生物产生的糖苷酶将糖苷水解而获取苷元，因此肠道微生物糖苷酶的活性决定了人体吸收中药有效成分的能力，这也就是中药“因人而异”的原因之一。

化学法利用强酸水解淫羊藿苷生产淫羊藿素，但由于酸水解效率不高，而且通常会导致烯烃键上的甲基和酚羟基脱水成环而不可避免地产生大量副产物-脱水淫羊藿素(CAS号38226-86-7)，导致产率低，生产成本高，且过量使用强酸对环境的压力大。

目前有报道用特殊葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶复配后，在常温，中强酸条件下水解淫羊藿苷生产淫羊藿素。该方法具有对环境友好，而且无副产物产生等诸多优点。但是其以下缺点也不容忽视：

1.由于酶对底物的特异性，目前只有生产两种催化剂(酶)才能获得淫羊藿素，因此催化剂的生产成本被提高。另外，两种酶水解条件的差异性，导致水解反应效率的下降；

2.底物淫羊藿苷的水溶性极低(溶于乙醇、乙酸乙酯，难溶于水，不溶于醚、苯、氯仿)，即使在甲醇中溶解度也不超过3mM。而常规的酶制剂只能在水相中，且无法耐受高浓度的有机溶剂。因此酶水解的工作浓度很低，最终导致水解体积过大，加大后续纯化工作的压力；

3.高温会导致酶失活，因此通常酶的工作温度为25-40℃。但是这样的温度过低，不利于底物在水相中溶解，变相降低了酶促反应速度，最终到账时空产率低；

4.目前报道酶法生产淫羊藿素的生产周期为48-96小时，反应周期长，酶容易失活，时空产率不高，最终导致生产成本上升。

基于酶法水解淫羊藿苷生产淫羊藿素的优缺点，我们必要进一步寻找一种高效的、耐底物浓度高、热稳定性强且底物谱广的糖苷酶，以满足大规模工业生产淫羊藿素的需要。

发明内容