[发明专利]一种在微流场中利用烯还原酶生成（S）-2-甲基环己酮的方法

说明书

本发明公开了一种在微流场中利用烯还原酶生成（S）‑2‑甲基环己酮的方法，包括如下步骤：S1：利用（R）‑选择性的烯还原酶催化非天然反应‑脱氢反应，拆分消旋的2‑甲基环己酮得到2‑甲基‑2‑环己烯‑1‑酮和（S）‑2‑甲基环己酮；S2：利用（S）‑选择性的烯还原酶催化天然反应‑还原反应，还原2‑甲基‑2‑环己烯‑1‑酮得到（S）‑2‑甲基环己酮。本发明利用两步酶组合催化将消旋的2‑甲基环己酮去消旋化得到难合成的（S）‑2‑甲基环己酮，具有反应条件温和、可持续性强、产物收率高、光学纯度高等优点。

技术领域

本发明属于化学合成技术领域，特别涉及一种在微流场中利用烯还原酶生成(S)-2-甲基环己酮的方法。

背景技术

(S)-2-甲基环己酮是非常重要的药物前体，可以用来合成许多高附加值药物中间体，在医药合成领域的具有一定的应用潜力。然而，目前合成(S)-2-甲基环己酮的方法中多有金属氢化物介导、Pd配体参与、极端温度和/或极端pH等苛刻条件。由于金属催化剂的毒性，并且这些苛刻条件给(S)-2-甲基环己酮的合成带来挑战，越来越多的科学家致力于研究高效绿色合成(S)-2-甲基环己酮方法。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供一种在微流场中结合烯还原酶及其突变株对消旋的2-甲基环己酮去消旋化合成(S)-2-甲基环己酮的方法(图1)。

为了解决上述技术问题，本发明设计的反应装置如图2所示。以消旋的2-甲基环己酮为原料，固定化的烯还原酶作为生物催化剂进行催化，主要分为两个反应步骤：首先利用野生型烯还原酶催化的非天然反应-脱氢拆分反应，将(R)-2-甲基环己酮脱氢生成2-甲基-2-环己烯-1-酮；在提供辅酶循环的条件下，再利用工程化烯还原酶催化2-甲基-2-环己烯-1-酮还原得到(S)-2-甲基环己酮。

具体地，所述反应包括如下步骤：

S1：以2-甲基环己酮为原料，将固定在树脂上的野生型烯还原酶固定在第一微通道中，利用野生型烯还原酶催化的脱氢拆分反应，在第一微通道中将(R)-2-甲基环己酮催化成2-甲基-2-环己烯-1-酮；

S2：将工程化的烯还原酶和葡萄糖脱氢酶(GDH)吸附在树脂上作为生物催化剂固定到第二微通道中，注射S1反应液到第二微通道，并连续添加NADP⁺和葡萄糖，将2-甲基-2-环己烯-1-酮还原得到(S)-2-甲基环己酮。

步骤S1中，所述烯还原酶TsER的制备方法如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烯还原酶TsER的基因构建到pET-28a(+)载体上，并转入到大肠杆菌BL 21(DE3)中，培养并纯化得到对应的烯还原酶TsER。

其中，SEQ ID NO.1是通过对序列号为Q5SLY6的序列改良而来，Q5SLY6序列总长1050，可以在NCBI上搜索得到。SEQ ID NO.1序列总长1059，其中，前端三个碱基属于限制性内切酶位点，后端六个也是限制性内切酶位点。

步骤S1中，反应的溶剂为磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，50mM，pH 7.4)与有机溶剂的混合物，所述有机溶剂包括但不限于正庚烷、异辛烷、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二甲基亚砜；其中，有机溶剂的体积小于等于反应总体积的百分之一。

步骤S1中，所述野生型烯还原酶为来源于Thermus scotoductus SA-01的TsER。

步骤S2中，所述工程化烯还原酶为来源于Thermus scotoductus SA-01的TsER的突变株TsER C25G/I66T，突变的思路可参照期刊ChemBioChem.2017,18(7),685-691。