[发明专利]一种在微流场中利用烯还原酶生成（S）-2-甲基环己酮的方法

权利要求书

1.一种在微流场中利用烯还原酶生成（S）-2-甲基环己酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：以2-甲基环己酮为原料，将固定在树脂上的野生型烯还原酶固定在第一微通道中，利用野生型烯还原酶催化的脱氢拆分反应，在第一微通道中将（R）-2-甲基环己酮催化成2-甲基-2-环己烯-1-酮；

S2：将工程化的烯还原酶和葡萄糖脱氢酶吸附在树脂上作为生物催化剂固定到第二微通道中，注射步骤S1得到的反应液到第二微通道，并连续添加NADP⁺和葡萄糖，将2-甲基-2-环己烯-1-酮还原得到（S）-2-甲基环己酮。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述野生型烯还原酶为来源于Thermus scotoductus SA-01的TsER。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述工程化烯还原酶为来源于Thermus scotoductus SA-01的TsER的突变株TsER C25G/I66T。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，TsER的制备方法如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烯还原酶TsER的基因构建到pET-28a（+）载体上，并转入到大肠杆菌BL 21（DE 3）中，培养并纯化得到对应的烯还原酶TsER。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，烯还原酶吸附在树脂上固定的方法为：将培养并纯化得到的烯还原酶分散于浸有树脂的磷酸盐缓冲液中，于20~22℃下缓慢搅拌后，取出树脂，于-80℃冷冻12 h，而后于冻干机中除水，将干燥的固定化树脂填充到微通道中。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，反应溶剂为PBS缓冲液与有机溶剂的混合物，所述有机溶剂为正庚烷、异辛烷、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二甲基亚砜中的任意一种或几种；其中，有机溶剂的体积小于等于反应溶剂总体积的百分之一。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1和S2中，所述树脂为水性吸附树脂ES-1、ES-103B和ES-108中的任意一种；树脂、纯酶的用量比为400~1300 mg：126 µg。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1和S2中，反应的温度为25~35℃，反应的停留时间为15~60 min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述的GDH为来源于芽孢杆菌的商业化酶。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1和S2中所述2-甲基环己酮、TsER、TsER C25G/I66T、GDH用量比为5~20 mM：3~5 mg：3~5 mg：30~50 U。