[发明专利]一种基于原位杂交法的EB病毒检测方法

说明书

本发明公开了一种基于原位杂交法的EB病毒检测方法，所述检测方法采用EBER特有序列设计的地高辛标记探针特异的与组织或细胞中的EBER靶序列互补、杂交，对细胞或组织样本中的EB病毒进行定性分析，包括样本脱蜡处理、酶处理、滴加EBER探针及配套的二抗、DAB显色、复染、脱水透明和封片等步骤。本发明提供的检测方法，选择鼠抗地高辛抗体、羊抗鼠抗体和酶标抗羊IgG聚合物作为配套EBER探针使用的二抗系统，使得探针与细胞或组织切片中核酸杂交结合的特异性好，能够扩大杂交信号，提高了检测的准确度和灵敏度。

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种基于原位杂交法的EB病毒检测方法。

背景技术

EB病毒(Epstein—Barrvirus，EBV)属于疱疹病毒，基因组长172kb，与多种肿瘤与非肿瘤性疾病有关，常见的如鼻咽癌、胃癌、鼻型NK/T细胞淋巴瘤、霍杰金淋巴瘤等等。根据国际癌症研究署对致癌因子的分类标准，EB病毒被列在第一组致癌因子中。目前研究认为呼吸道是EBV潜伏的最大场所，主要是通过人类唾液传播，有嗜人淋巴细胞特性。首先感染人口咽部组织上皮细胞，随后播散到周围血B淋巴细胞、呈潜伏感染状态。世界上大多数人在幼儿期就可感染EBV，并终身携带。

EBER是EB病毒编码的一种小RNA，是EB病毒的表达产物，以高拷贝存在于被感染的细胞核中，在EB病毒感染的任何时期均持续转录，包括潜伏期和病毒复制期。目前用于EBV检测方法很多，如血清抗原抗体反应、免疫组织化学、聚合酶链反应(PCR)等，但EREB原位杂交检测技术的定位准确、敏感性高和特异性强，已成为公认的EB病毒标准检测方法。EBER原位杂交检测阳性已成为判断器官组织标本EBV感染的金标准。另外，EREB原位杂交技术在检测EBV时具有定位作用，能够确定病毒与组织和细胞的关系。检测EB病毒原位感染的临床意义为：(1)有助于EB病毒相关疾病诊断和鉴别诊断：比如鼻咽癌与鼻咽部其他肿瘤的鉴别；EBER在鼻咽癌几乎100％肿瘤细胞核呈阳性，结外NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)理论上100％阳性，多数慢性炎性相关弥漫大B细胞淋巴瘤显示阳性，浆母细胞淋巴瘤阳性率为60～75％，霍奇金淋巴瘤阳性；(2)了解疾病的病因或疾病相关因素，对疾病的认识更深刻；(3)了解预后和指导治疗：当病理医师报告了病变中存在EB病毒感染，临床医师可以采用一些已知的抗病毒治疗方法，如干扰素、罗昔洛韦、EB病毒特异细胞毒性T细胞和中药等。

原位杂交(In Situ Hybridization)是指将特定标记的已知顺序核酸为探针，与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程，原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。目前，原位杂交法的检测质量往往取决于以下因素：(1)探针、一抗和二抗系统的选择：探针、一抗和二抗系统的选择上应尽可能的选择特异性强、灵敏度高、结合能力好的探针和一、二抗，扩大杂交信号；(2)组织固定脱水的质量：组织固定不及时或不足，容易导致细胞核酸断裂，蛋白质溶解，从而使得胃酶消化后的组织细胞结构模糊，导致杂交检测结果不能判读或呈阴性；组织脱水不良则有可能引起强烈的非特异性背景染色，从而影响检测结果判读；(3)胃酶消化质量：胃酶消化的结果将影响探针和目标核酸的杂交结合程度，引起阳性减弱或者假阴性等结果；(4)变性、杂交的温度与时间：在杂交变性过程中，特别是DNA变性杂交温度必须达到预设温度，变性温度过低导致DNA双链不能打开，探针不能与目标DNA结合，出现假阴性检测结果；(5)操作流程的规范性：在检测过程中的干片、未使用杂交洗液、PBS清洗不足、DAB显色时间过长等因素有可能引起组织内非特异性背景染色。其中，探针的特异性以及一抗、二抗系统的选择在原位杂交法检测的过程中尤为关键。

因此，本领域亟需开发一种灵敏度高、特异性好、杂交信号大的检测方法，在提高检测准确度的同时，还能够方便操作，提高检测效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于原位杂交法的EB病毒检测方法，采用EBER探针特异的与样本中的EBER靶序列互补、杂交，对细胞或组织样本中的EB病毒进行定性分析，包括以下步骤：