[发明专利]一种基于原位杂交法的EB病毒检测方法

权利要求书

1.一种基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，采用EBER探针特异的与样本中的EBER靶序列互补、杂交，对细胞或组织样本中的EB病毒进行定性分析，包括以下步骤：

1)制备EBER检测试剂盒试剂，所述EBER检测试剂盒试剂包括EBER探针、胃酶工作液、鼠抗地高辛抗体、羊抗鼠抗体、酶标抗羊IgG聚合物、DAB色原浓缩液和DAB底物缓冲液；

2)样本准备：对待测细胞或组织样本进行取材、固定、脱水和石蜡包埋处理，制成蜡块，所述样本厚度为3-5μm，将所述样本黏附在聚赖氨酸载玻片上，在空气中干燥后，60℃烤片1-2小时；

3)酶处理：根据所述样本的大小，滴加1-3滴胃酶工作液，37℃下孵育10分钟，纯化水冲洗2次，最后使用空气干燥样本；

4)滴加探针：根据所述样本的大小，滴加EBER探针，加硅化盖玻片，使用橡胶水泥进行封边，37℃下杂交孵育2-4小时或过夜；

5)去除橡胶水泥，将样本浸入PBS缓冲液内10分钟，再用PBS缓冲液冲洗3次，每次2分钟；

6)滴加鼠抗地高辛抗体：向样本中加入1-3滴鼠抗地高辛抗体，至完全覆盖样本，在37℃下孵育30分钟，使用PBST冲洗3次，每次5分钟；

7)滴加羊抗鼠抗体：向样本中加入1-3滴羊抗鼠抗体，至完全覆盖样本，在室温下孵育10分钟，使用PBST冲洗3次，每次5分钟；

8)滴加酶标抗羊IgG聚合物：向样本中加入1-3滴酶标抗羊IgG聚合物，至完全覆盖样本，在室温下孵育30分钟，使用PBST冲洗3次，每次5分钟；

9)DAB显色：制备DAB工作液，向样本中加入DAB工作液，至完全覆盖样本进行染色，染色结束后使用纯化水冲洗样本；

10)复染：使用苏木素进行复染，复染后使用PBS或自来水冲洗返蓝；

11)脱水透明：将样本依次浸泡浓度梯度为70％-100％的酒精，再浸泡纯二甲苯进行透明处理，进行2次，每次3分钟，结束后对样品进行封片。

2.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述EBER探针、胃酶工作液、鼠抗地高辛抗体、羊抗鼠抗体和酶标抗羊IgG聚合物均为即用型试剂，所述EBER探针为特有序列设计的地高辛标记探针。

3.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述DAB为3,3’-二氨基联苯胺。

4.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述脱蜡处理是指将3-5μm的石蜡切片置于二甲苯中浸泡脱蜡2次，每次10分钟，随后置于无水乙醇中浸泡2次，每次3分钟，最后经空气干燥5-10分钟。

5.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤3)、6)、7)和8)中，所述孵育是指在原位杂交仪或湿盒内进行孵育。

6.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤8)中，所述酶标抗羊IgG聚合物为多聚体HRP偶联的二抗。

7.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤9)中，所述DAB工作液由所述DAB色原浓缩液和DAB底物缓冲液按比例混合而成，所述比例为每800μL的DAB底物缓冲液中加入一滴DAB色原浓缩液。

8.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤10)中，所述返蓝是指观察样本中的细胞核呈蓝色。

9.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤11)中，所述浓度梯度为70％、85％、95％和100％。

10.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤11)中，所述封片是指使用中性树胶对样品进行封片。

11.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述杂交孵育2-4小时或过夜是指在原位杂交仪内或湿盒内杂交孵育2-4小时或过夜。