[发明专利]一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法

说明书

本发明公开了一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法，涉及基因组测序技术领域。引物集包括：至少两个引物子集，引物集包括如SEQ ID NO.1‑202所示的101对引物。该引物集及高通量测序方法极大程度上精简了操作步骤，满足较少数据量条件下也能获得更高的测序深度，降低测序成本。甚至对于低质量的FFPE样品也能满足高通量测序需求。

技术领域

本发明涉及基因组测序技术领域，具体而言，涉及一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法。

背景技术

线粒体是细胞中提供能量代谢的重要细胞器，在生物体能量转换和新陈代谢中处于核心地位。人类体细胞中线粒体DNA(脱氧核糖核酸)的突变会引起氧化磷酸化和能量供应异常，进而引起150余种人类疾病的发生，例如心血管疾病、耳聋、神经退行性疾病及衰老等。

线粒体DNA的突变包括大片段的插入/缺失，小片段的插入/缺失，点突变等。突变可以发生在编码区，也可以发生在非编码区。目前需要快速捕获线粒体并进行高通量测序的技术不多，或者技术较为复杂。

现有专利CN106399553B提供的高通量测序方法通过73对引物分成4个子集分别扩增，该方法需要特定的核酸外切酶消化单链DNA，引物二聚体，再通过连接酶连接构建测序文库，操作复杂，且需要平均300Mbp的数据量才能达到较高的测序深度和序列覆盖度，测序成本大。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法以精简操作步骤，满足较少数据量条件下也能获得更高的测序深度，降低测序成本。甚至对于低质量的FFPE样品也能满足高通量测序需求。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种线粒体全基因组测序的引物集，其包括：至少两个引物子集，引物集包括如SEQ ID NO.1-202所示的101对引物。

发明人设计合成了多重扩增的引物，该多重扩增引物设计原则如下：

(1)引物退火温度Tm值范围58-64摄氏度；

(2)扩增产物长度分布在140-260bp之内；

(3)引物之间不会形成二聚体；

(4)覆盖线粒体序列全长。

通过设计上述101对引物，可以实现人线粒体全长的覆盖，覆盖率达99.8％以上。意味着在极少的数据量下，即可获得更高的测序深度，降低测序成本。

上述扩增引物可以降低模板使用量，可以稳定检测低至10ng的样品，甚至低质量的FFPE样品也可以。另外，本发明提供的引物集，产生的扩增产物长度较小(扩增产物仅为300bp左右)，可以兼容主流的Illumina测序平台的PE150以上测序读长，方便测序。

上述设置至少两个引物子集可以保证扩增产物的片段不会参差不齐，片段长度差异性过大导致扩增效率下降。同时也避免引物间隔太近，导致扩增产物长度差别太大，并进一步形成非特异性扩增。引物子集也可根据需要进行设置多个，只要满足相同引物子集内的各引物对之间没有重叠即可。例如设置2-10个子集。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述引物集包括2个、3个或4个引物子集。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述引物集包括如SEQ ID NO.1-102所示的第一引物子集和如SEQ ID NO.103-202所示的第二引物子集。

发明人发现，当引物子集为两个时，既能减少扩增的次数，两个子集相较于3个或4个子集等方式扩增次数分别减少了1次或2次，还能满足较高的人线粒体全长覆盖度。