[发明专利]一种基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法

说明书

本发明公开一种基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，包括如下步骤：(1)用Cas9/sgRNA特异性识别和切割靶DNA；(2)将切割产物连接成环状DNA；(3)通过HRCA反应对环状DNA进行扩增、检测。本发明所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，首先通过一对Cas9/sgRNA复合物特异性识别和切割靶DNA，然后将切割产物连接成环状DNA作为HRCA的模板，并通过HRCA反应对环状DNA进行大量地扩增。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶 DNA检测方法。

背景技术

CRISPR的序列通常存在于原核生物的基因组中，Jansen等在2002年对它进行了明确的定义。CRISPR系统是获得性免疫系统必要的组成部分，依赖于短的CRISPR-derivedRNAs(crRNAs)特异性识别和破坏外源性基因序列。Jinek等操纵CRISPR系统的三个 主要组分(反式激活crRNA、crRNA和CRISPR相关蛋白Cas9)成功地切断了细菌的双 链DNA，并将该系统的反式激活crRNA和crRNA整合在一起组成了单引导RNA (sgRNA)。随后，Cong等证明了Cas9/sgRNA复合物可用于精确地切割人类和小鼠细胞 中的基因组位。CRISPR系统因其简单和高效成为了最常见的基因编辑工具，并被广泛应 用于包括核酸检测在内的各个领域。目前，已经存在大量基于CRISPR-Cas的检测方法， 用来进行病毒检测，DNA甲基化检测，细菌检测，癌症筛查，单核苷酸多态性检测，耐 药性筛查等。将超高特异性的CRISPR-Cas9系统和扩增方法相结合来进行核酸检测具有 巨大的应用潜力。

CN 107828874 A公开一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用，PCR是 最常见的DNA扩增方法，但缺点是反应需要昂贵的热循环设备，这限制了其在实验室以 外的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，用 于快速灵敏地检测和分型靶DNA。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，包括如下步骤：

(1)用Cas9/sgRNA特异性识别和切割靶DNA；

(2)将切割产物连接成环状DNA；

(3)通过HRCA反应对环状DNA进行扩增、检测。

本发明步骤(1)用Cas9/sgRNA特异性识别和切割靶DNA，可以按照本领域常规方法设计根据靶基因序列设计sgRNA，利用Cas9核酸酶与靶向目的DNA的一对sgRNA混 合，形成Cas9/sgRNA复合物，该复合物可以在sgRNA的引导下，与靶基因结合并发生 双链切断。

本发明步骤(2)将切割产物连接成环状DNA可以按照本领域的常规方法，例如在本发明的一种实施例中，反应体系为每μL反应液中包含：0.2～0.5μL的切割产物、0.2～0.5U的T4 DNA连接酶、0.1～0.2μLT4 DNA连接酶缓冲液，余量为无RNase的H₂O； 反应条件为20～25℃下孵育8～12分钟。

在本发明的一种实例中，本发明步骤(3)通过HRCA反应对环状DNA进行扩增时 添加一对与环状DNA双链分别互补的引物。引物的设计方法可以按照本领域的常规方法 进行。通过添加与环状DNA双链分别互补的引物对，不仅可以保证扩增效率，并可进一 步提高本发明所述检测方法的特异性。