[发明专利]一种基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法在审
| 申请号： | 202210332874.1 | 申请日： | 2022-03-31 |
| 公开（公告）号： | CN114891860A | 公开（公告）日： | 2022-08-12 |
| 发明（设计）人： | 张贝贝;李苗;王艳歌;杜恩明;魏圆梦;王娇娇;宋宗明 | 申请（专利权）人： | 河南省人民医院;河南省立眼科医院（河南省眼科研究所） |
| 主分类号： | C12Q1/6844 | 分类号： | C12Q1/6844 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人： | 杜静 |
| 地址： | 450000 *** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 crispr hrca 技术 可视化 dna 检测 方法 | ||
1.一种基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用Cas9/sgRNA特异性识别和切割靶DNA；
(2)将切割产物连接成环状DNA；
(3)通过HRCA反应对环状DNA进行扩增、检测。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(2)反应体系为每μL反应液中包含：0.2～0.5μL的切割产物、0.2～0.5U的T4 DNA连接酶、0.1～0.2μLT4 DNA连接酶缓冲液，余量为无RNase的H2O。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(2)反应温度为20～25℃。
4.根据权利要求3所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(2)反应孵育时间为8～12分钟。
5.根据权利要求1所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(3)通过HRCA反应对环状DNA进行扩增时添加一对与环状DNA双链分别互补的引物。
6.根据权利要求1所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(3)的反应体系为为每μL反应液中包含：0.03～0.04μL环状DNA、0.06～0.08μL与环状DNA双链分别互补的引物对、0.03～0.04μLdNTP、0.05～0.15μLThermoPol缓冲液、0.015～0.02μL Bst DNA聚合酶，余量为无RNase的H2O。
7.根据权利要求1所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(3)的反应体系中的Bst DNA聚合酶单独加入，在加入前先进行孵育，加入后再进行反应孵育。
8.根据权利要求7所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(3)在加入Bst DNA聚合酶前在90～96℃下孵育8～12分钟。
9.根据权利要求7所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(3)加入Bst DNA聚合酶后55～65℃下孵育50～70分钟。
10.根据权利要求1所述的基于CRISPR和HRCA技术的可视化靶DNA检测方法，其特征在于，步骤(3)检测具体为将HRCA扩增产物加入SYBR Green I染料混合，进行可视化检测。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于河南省人民医院;河南省立眼科医院（河南省眼科研究所），未经河南省人民医院;河南省立眼科医院（河南省眼科研究所）许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
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