[发明专利]一种对分裂位点进行筛选的方法及其应用

说明书

本发明提供一种对分裂位点进行筛选的方法及其应用。所述方法包括步骤：S1、数据库建立：使用计算机语言编写程序，预测内含肽在氨基酸序列中的每相邻的两个氨基酸残基中嵌入后都发生了剪接反应将自身切除，相邻肽段相连后形成的氨基酸序列组成蛋白数据库；S2、实验进行：在基因片段中插入内含肽序列片段后进行分子克隆，翻译后得到肽段，将该肽段通过质谱检测是否含有标记氨基酸序列，并与所述蛋白数据库进行比对，实现对断裂位点的证实。本发明的方法先通过计算机编程构建蛋白数据库，再进行实验并通过质谱实现分裂位点的检测和证实；通过质谱实现最终的检测，代替高通量筛选，将其拓展到可以将任意活性蛋白进行分裂位点的寻找。

技术领域

本发明涉及蛋白分裂位点筛选领域，具体涉及一种对分裂位点进行筛选的方法及其应用。

背景技术

蛋白内含肽能够将侧翼外蛋白(外部蛋白)连接成一个新的蛋白质片段，并将其本身切除出去，这一过程被称为蛋白质剪接。内含肽在许多自然生物中被发现，如细菌、真菌和低等植物，通常嵌入在重要的蛋白质中。在自然界中，蛋白质剪接产生两个独立的蛋白质(内含肽和外显蛋白)并在一个基因的控制下内含肽精确切除内部蛋白质片段(内含肽本身)和同时连接两边区域。自然界存在的蛋白内含肽存在几种形式，包括全长内含肽，迷你内含肽和自然产生的分裂内含肽。全长内含肽和迷你内含肽都是顺式剪接的内含肽，在其中存在或不存在一个内切酶结构域。分裂内含肽是反式剪接的内含肽，包含两个蛋白片段并且它们是由两个独立的基因转录和翻译而来。反式剪接需要两个分裂的内含肽片段共同表达，即N-蛋白(IN，与N-外显蛋白的C端融合)和C-蛋白(IC，与C-外显蛋白的N端融合)。分裂的内含肽片段随后结合以恢复其活性，并催化N-外显蛋白和C-外显蛋白的连接。在顺式或反式剪接中，内含肽介导的剪接化学反应不需要任何酶或辅助因子的帮助，而只要求表达蛋白具有正确折叠结构。

现有科技文献(“A systematic approach to inserting split inteins forBoolean logic gate engineering and basal activity reduction”，Baojun Wang等，nature communications，2021)记载了一种蛋白分裂位点筛选的方法，名称为Intein-assisted bisection mapping(IBM)split site screening，也是基于噬菌体侵染机制介导的mini-Mu transposon随机插入基因片段的方法，但其仅限于已经成功搜寻到分裂位点的一些荧光蛋白或抗生素抗性蛋白，这些蛋白本身可以激发荧光或是在抑制抗生素和在转录启动原件中有调控作用，使得它们具有可被高通量筛选检测出活性的特质。然而，大多数的重组蛋白，如IL-2、IFN、EGF、bFGF等这些具有高价值的蛋白药物，均没有可通过高通量筛选直接检测出来的特性。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种对分裂位点进行筛选的方法，先通过计算机编程构建蛋白数据库，再进行实验并通过质谱实现分裂位点的检测和证实；通过质谱实现最终的检测，代替高通量筛选，将其拓展到可以将任意活性蛋白进行分裂位点的寻找。

作为前提，本发明的实验原理(即关于噬菌体侵染机制介导的mini-Mutransposon随机插入基因片段的方法)与上述科技文献“A systematic approach toinserting split inteins for Boolean logic gate engineering and basal activityreduction”相同，若在本申请的文本中，对于相关作用原理的表述不够清楚，该文献也可作为解释。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种对分裂位点进行筛选的方法，其包括步骤：

S1、数据库建立：使用计算机语言编写程序，预测内含肽在氨基酸序列中的每相邻的两个氨基酸残基中嵌入后都发生了剪接反应将自身切除，相邻肽段相连后形成的氨基酸序列组成蛋白数据库；