[发明专利]快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法

说明书

本发明提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法，试剂盒包括CMV引物，所述CMV引物的序列为：CMV‑F：5′‑cggtattgaacgctgcgttattcacgctgg‑3′，CMV‑R：5′‑ctaggataaccttgaattgctccatccacgc‑3′。本发明可以在田间实现短时、准确的批量检测CMV病毒，操作方法简单易行，具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等特点，可以实现常温操作，常温反应以及常温保存，非常适合田间大规模快速检测。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，涉及快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法。

背景技术

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。黄瓜花叶病毒(CMV)是一种植物病毒，它能攻击包括百香果在内的多种植物，就可能感染的物种而言，它是分布最广的植物病毒。它主要通过蚜虫传播，有时通过种子传播。与所有植物病毒一样，对感染的植物没有治疗方法。对付这种病毒的最好办法是培育抗病品种并根除受感染的作物以防止传播，所以开发出一种能够实现田间快速检测该病毒的方法成为了重中之重。

百香果CMV病毒病发病时叶片带浅黄色斑驳，病叶皱缩，严重时叶片反卷。部分果实畸形硬化，果肉少或无，植株生长不良，产量低，品质差。它的可怕之处在于目前无法通过药物治愈，植株显症后不是直接销毁，就是收果后缓期销毁，因为植株发病后打药成本会不断增加，产量和品质却越来越差，严重影响果农收益。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法，利用RNA恒温快速扩增荧光型试剂盒(MIRA)可以在田间实现短时、准确的批量检测CMV病毒。

为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒，包括CMV引物，所述CMV引物的序列为：

CMV-F 5′-cggtattgaacgctgcgttattcacgctgg-3′，

CMV-R 5′-ctaggataaccttgaattgctccatccacgc-3′。

优选地，还包括CMV探针，所述CMV探针的序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；所述CMV探针共有四个修饰位点：距离5′端的≥35nt的中部位置标记一个dSpacer THF，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2-4nt；THF距离3′末端≥15nt，并且3′末端标记一个修饰基团。

更优选地，所述修饰基团选自胺基、磷酸基团或C3-Spacer。

优选地，所述CMV探针的序列为tacctgggatgtgcccacccgaac[FAM-dT]c[THF][BHQ1-dT]tcgacattgtattt[C3-spacer]。

本发明还提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的方法，包括：

1)向反应管中加入上游引物、下游引物、探针、RNase-free水、核酸模板和缓冲液；

上游引物的序列为：5′-cggtattgaacgctgcgttattcacgctgg-3′，

下游引物的序列为：5′-ctaggataaccttgaattgctccatccacgc-3′，

探针序列为：tacctgggatgtgcccacccgaac[FAM-dT]c[THF][BHQ1-dT]tcgacattgtattt[C3-spacer]；