[发明专利]一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法

说明书

本发明提供一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法，包括以下步骤：(1)向N个酶活性已知但不同的碳酸酐酶标准品中加入缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n，建立反应液n的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k，建立碳酸酐酶标准品的酶活性与反应速率k的标准工作曲线；其中，所述反应底物包含二氧化碳；(2)向待测样品中加入步骤(1)中的缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n₀，建立反应液n₀的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k₀；(3)根据反应速率k₀和标准工作曲线，得到待测样品中碳酸酐酶的酶活性。本方法操作简单、准确度高、对设备要求低且适用测量生物样品中碳酸酐酶的酶活性。

技术领域

本发明涉及血红蛋白类氧载体技术领域，具体涉及检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法。

背景技术

血红蛋白类氧载体(Hemoglobin-Based Oxygen Carriers，HBOCs)是一种新兴的具有携氧功能的血液代用品，具有可长时间保存、无需配型、便于运输、感染风险低等优点，但其表现出良好治疗效果的同时也存在氧化应激、影响血管收缩、产生肾毒性损伤等毒副作用。有研究将血红蛋白与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和碳酸酐酶(CA)复合来制备PolyHb-SOD-CAT-CA，以解决上述问题。为进一步优化此类HBOCs产品的性能，对以上三种酶进行酶活性测定很有必要。其中碳酸酐酶(CA)广泛存在哺乳动物的组织中并参与机体多种生命活动，其作用主要使催化二氧化碳转化为碳酸、控制生物流体(如血液)的酸度。常见的CA的酶活测定方法有测压法、比色法、电极法和酯酶测定法等，但测压法操作繁琐，且测定误差较大，比色法使用的指示剂往往对酶的活性会存在影响，测定结果不够准确，电极法对设备要求较高，且测得的酶活的线性响应范围较小，酯酶测定法只能测定具有酯酶活性的碳酸酐酶的酶活。

因此，亟需一种操作简单、对设备要求低、测定结果准确且适用生物样品的碳酸酐酶的酶活性检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、对设备要求低、适用生物样品的碳酸酐酶的酶活性检测方法，本发明的方法测定过程中酶活性不受生物样本和指示剂的影响，准确度高。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)向N个酶活性已知但不同的碳酸酐酶标准品中加入缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n，建立反应液n的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k，建立碳酸酐酶标准品的酶活性与反应速率k的标准工作曲线；

其中，所述反应底物包含二氧化碳；

(2)向待测样品中加入步骤(1)中的缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n₀，建立反应液n₀的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k₀；

(3)根据反应速率k₀和标准工作曲线，得到待测样品中碳酸酐酶的酶活性。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤(1)中待测样品为牛血或血红蛋白类氧载体原液稀释液。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤(1)中缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液。

根据本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中反应底物为二氧化碳饱和溶液。

根据本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中酸碱指示剂为溴百里酚蓝。

根据本发明的优选实施方式，在25℃水浴下，向溴百里酚蓝水溶液中通入CO₂气体，得到含溴百里酚蓝的CO₂饱和溶液。